简述转基因技术原理

.转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。1992年荷兰培育出植入了人促红细胞生成素基因的转基因牛，人促红细胞生成素能刺激红细胞生成，是治疗贫血的良药。转基因技术标志着不同种类生物的基因都能通过基因工程技术进行重组，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，创造新的生命类型。同时转基因技术在药物生产中有着重要的利用价值。转基因技术，包括外源基因的克隆、表达载体、受体细胞，以及转基因途径等，外源基因的人工合成技术、基因调控网络的人工设计发展，导致了21世纪的转基因技术将走向转基因系统生物技术 2000年国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程与转基因技术。1.转基因的细胞学原理：(1)细胞周期及MPF：细胞周期可人工分成4个时期，分别为G1期、S期、G2期和M期。细胞在正常情况下，沿着G1-S-G2-M路线运转。S期为DNA合成期，M期为有丝分裂期，M期结束到S期开始之前为G1期，S期末到有丝分裂期(M期)为G2期。有丝分裂的启动由成熟促进因子也叫M期促进因子(maturation/mitosism/meiosis promoting factor，MPF)调控，MPF在细胞分裂中呈周期性变化即分裂后逐渐积累，到G2晚期达到高峰，由中期向后期转换时骤然消失。因此推测MPF是真核细胞M期的一个基本调节物质，能引导细胞由间期向M期转变。MPF由蛋白激酶激活，存在于所有的真核细胞中(包括减数分裂的性细胞)。但并非所有的细胞都是周期中细胞，某些细胞在一定的条件下可以脱离细胞周期进入G0期或分化为不分裂的细胞，而且G0期细胞可通过诱导重新进入周期。(2)通过M期的卵母细胞转基因：M期的卵母细胞的MPF含量很高，可以诱导细胞核发生一系列变化包括核膜破裂(NEBD)和早熟染色体凝集(premature chromosome condensation，PCC)，处于减数分裂M期的卵母细胞无核膜的时间远远长于有丝分裂M期的细胞。所以此时期的卵母细胞可作为基因导入的受体。据此1998年Anthonv等对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎方法加以改进，用逆转录病毒载体注射M期的卵母细胞，注射完毕的卵母细胞同获能后的精子共同孵育后，体外发育至囊胚，再移植到母牛体内得到了转基因小牛。1999年Anthonv等又将精子与外源基因共孵育，然后将精子头部显微注射入M期的卵母细胞，这两种方法共同之处都是利用M期的卵母细胞无核膜，外源基因易导入的特点。2.转基因的胚胎学原理：(1)哺乳动物转基因的胚胎学原理：精子和卵子只有发育成熟后，精卵相遇时才能完成受精过程。精子进入卵子后头尾分离，胞核出现核仁，形成核膜，头部膨大形成雄原核；同时卵子排出第二极体形成雌原核。一般来说雄原核比雌原核大。接着雌雄原核的核膜消失，雌雄原核融合。随后细胞周期性卵裂，分裂球增加到32个时形成桑葚胚，进入子宫再发育至囊胚，此前的胚胎细胞具有很强的分化能力。从哺乳动物受精卵分裂发育的规律来看，转基因操作时较合适的部位是受精卵的雄原核，精子进入卵细胞后的1小时，雄原核和雌原核还未融合，在显微镜下容易看到雄原核。多数研究者在此时期把外源基因显微注射到雄原核，通过雌雄原核的融合把外源基因整合入受精卵。有的研究者认为，注射时间应选在精卵融合后的受精卵有丝分裂S期进行，外源基因可以借助受精卵自身基因组DNA复制时形成的缺口或缝隙及重组过程，整合到受精卵的基因组中。(2)禽类转基因的胚胎学原理：家禽与哺乳动物相比其生殖生理特点有所不同，家禽卵子在输卵管中遇到精子完成受精，可能有多个精子进入卵细胞，精子进入时，卵子处于第二次分裂中期。精子入卵后，卵子排出第二极体，此时二者分别形成雄原核、雌原核，然后雌雄原核融合，雄原核很快被包上一层脂粒。融合后的受精卵在输卵管前移的过程中一边分裂，一边形成卵清、蛋壳等，鸡蛋产出体外时，已发育到6 000个细胞的囊胚期。由于单细胞期的卵子不易获得，因此不宜对卵子进行基因操作。鸡卵子受精时有多个精子进入卵细胞，无法辨清哪一个精子与雌原核融合，且雄原核很快包上一层脂粒，所以也无法像哺乳动物那样对雄原核注射。所以鸡的转基因操作，一般选择在刚产出蛋(即未孵蛋)的胚盘进行注射，注射位置是受精卵胚盘中央质膜下方30m处的囊胚腔，靠近雌原核。(3)鱼类转基因的胚胎学原理：Ozato等(1986)曾将外源基因注射到V期卵母细胞核中，使这种注射了外源基因的卵母细胞在体外成熟、受精，然后获得转基因鱼，但卵母细胞能够在体外条件下完全成熟的鱼类只有三种即金鱼、斑马鱼、青锵，所以这种方法受到限制。对于其他的鱼类，通用的方法是把外源基因注入细胞质。鱼卵子外被卵壳，存在受精孔，精子自受精孔进入卵子，受精后，受精卵的核看不清楚。但鱼卵是端黄卵，受精后，位于植物极端的细胞质向动物极方向集中而形成卵内细胞质流。这种细胞质流有助于导入的外源基因与受精卵原核DNA的接触。所以转基因鱼的制作是把外源基因注射到受精卵的卵原核附近的细胞质内，注射在第一次卵裂前进行。与哺乳动物不同的是鱼受精卵的发育是在体外进行的，无需进行胚胎移植，由此大大简化了转基因的程序。3.转基因的分子生物学原理：无论是显微注射法、电穿孔法等物理方法，还是逆转录病毒载体法等生物学方法，目的是把外源基因导入细胞或胚胎，然而要得到转基因动物的关键是外源基因的整合和表达效率。Brinster提出假设，注入的DNA分子游离末段的诱导修复酶可能引起染色体的随机断裂，断裂点可能是整合位点，外源DNA分子游离末端和断裂点之间的相互作用能够诱导外源DNA整合入基因组。由于这种随机断裂、随机整合的位置效应，研究者很难驾驭转基因的表达效率和表达水平，而且实际应用中注射DNA线性分子比环性的整合效率要高。既然断裂是随机的，则转基因插入也是随机的，由此可导致内源基因的重排、缺失、移位，引起表达效果不理想。但也有一些基因构件不存在位置效应，其表达水平与该基因在宿主基因组中的拷贝数有关，某些情况转基因在整合位点上表现出独立性表达，如溶菌酶基因的“A”元件等。外源基因整合后，当受体基因中含有转基因的同源序列时，转基因与内源基因的表达会同时受到抑制，这种现象称为共抑制，一般发生在转基因与同源的内源基因之间或者两个相同的转基因之间。共抑制的原因可能是：转基因与同源基因相互作用后，造成某种后成的存在性状而影响其表达；同源基因竞争性地结合核基质等结构出现相互抑制；产生反义RNA，并且正义链的RNA与其结合后而快速降解；由于外源基因的存在，使mRNA开始时大量堆积，并激发某种未知的机制使mRNA降解。许多研究者认为，转基因整合后由于所处的位置不合适，不能建立自己的结构域，从而无法独立调控，当然也无法表达。鸡溶菌酶基因的核基质附着区(DPA因子)，可以帮助转基因在不同的整合位点上形成完整的结构域(转基因即表达)。转基因表达量低也可能是因为存在翻译水平的错误剪接而影响其表达。近年来内含子对转基因表达的作用受到人们的重视，1991年Palmiter等进一步证实内含子能提高转基因动物的表达效率。据研究5末端的内含子有利于进行mRNA的有效剪接，所以进行转基因操作，应尽量保留5末端的内含子。随着研究的深入，对转基因的低水平表达又有新的解释，其理论认为，转基因不表达是由于多拷贝重复序列导致了该区域异染色质化从而使转基因沉默。Steven提出这种沉默是真核生物基因组受到其他序列威胁时出现的一种保护机制。Garrick(1998)等通过转基因鼠试验为上述解释找到了科学依据。外源基因进入细胞后，细胞对外来物质有个防卫系统，细胞内的核酸酶能降解外源基因，使得外源基因得到有效控制。如果核酸酶未完全降解掉外源基因，细胞会启动外源基因甲基化系统来抵制外源基因。Doerler在研究中还发现外源基因在细胞中的甲基化是一种普遍现象。甲基化的外源基因在分裂过程中不稳定，经过多次分裂后，外源基因通过一些目前未知的机制而降解掉，从而从基因组中丢失，影响转基因的效率。类似于 :参考文献 1王保存著 .世界新军事变革新论 .解放军出版社 , 2003年版2黄宏主编 .世界新军事变革报告. 人民出版社 , 20044 徐珏,董文.转基因作物现状及其安全性研究进展J. 科技信息(学术研究). 2007(16)5 、安全性评估进展 5. 1转基因作物安全性评估的重要性 转基因作物的食品安全性一直是争论的焦点。 在美国转基 因食品销售的 1 0多年中 ,尚未发现一例食品安全事故。美国对 抗草甘膦大豆进行分析 ,发现其含油量、灰份、纤维、碳水化合 物、蛋白质和氨基酸无明显变化8 。我国水稻研究所创制的转基 因抗草铵膦水稻饲喂小鼠无致突变作用 ,饲喂大鼠 ,大鼠生育、 体重、食物利用率、血常规和病理组织学等指标无显著变化 9。 但是 ,大部分欧盟国家对转基因作物持谨慎态度 ,“保留在 发现转基因食品存在安全风险的情况下拒绝购买此类食品的权 利”。有的研究也发现转基因作物的安全隐患 ,如苏格兰 Row ett 研究院的 Putsai 博士曾声称培育了带 lectin基因的改良马铃 薯 ,但是这种马铃薯能够破坏老鼠的肝脏和免疫系统 10 。 也有研究人员推测转基因食品对人类健康的隐忧: (1)可能 有不明确的毒素对人体产生毒害作用; (2)可能含有某种过敏 原 ,造成人体过敏反应 ; ( 3)可能某些营养成分或物质发生改变 , 引起营养失衡; (4)转入植物体内的基因可能会整合到人类染色 体上 ,导致一些难以预见的疾病。 另外 ,转基因作物的基因安全性问题也不容忽视 ,其最大的 潜在危害就是抗性基因的逃逸和污染。 栽培作物与栽培作物之 间 ,栽培作物与野生种之间 ,栽培作物和杂草之间都存在种间基 因漂移的可能。 抗性基因的逃逸可以通过与野生近缘种发生花 粉杂交 (cross- pollination),也可以通过水平基因转移 ( horizontal gene transfer)发生逃逸 11- 12。其抗性基因的逃逸可能会 使周围作物受到影响 ,从而改变一个地区的生态环境。8 Deborah Delmer,高亮.转基因作物和食品安全J. 华中农业大学学报. 2014(06)关于转基因的一些虚假言论 妄言转基因技术与转基因作物不安全 任何以事实为依据的讨论必须首先澄清一个关 键的问题：如今种植的转基因作物对于人类和动物 来说是安全的。在转基因产品过去经历的年中， 没有人能给出合理的说法证明农作物中的转基因性 状对人甚至动物造成了危害。只要农业政策方面出 台了合理的监管制度，在将来我们就不用再担心转 基因作物的安全问题了。然而，反对转基因的激进 分子已经花了上百万美元向百万民众反复宣传转基 因作物有危害且不可食用。不幸的是民众相信了他们的言论。科学团体和政府机构有责任去反对这样 的言论，并且应该依据科学观点传达转基因作物的 安全性。 近来写到 ：“我们应该跳 出这样的思维，转基因作为一种遗传改良技术，它和 其他的作物改良技术包括传统的育种是一样的，我 们不应该认为转基因技术有什么特殊之处。”就像 说的，我一直认为，当我们评判一个新品种 时，我们应该关注的是该品种中出现的新性状的价 值和安全性，而不是它产生的方法和过程。例如，如 果抗除草剂的作物是由于大量种子经过辐射引发突 变的群体中筛选而来，即使这个种子也包含许多别 的未被鉴定的突变表型，我们也无需特别的规范来 批准它的使用。相反的，我们却需要用全套的规范 流程来批准用转基因方法获得的同样抗除草剂作物 的使用，即使插入的是我们已经鉴定过的基因。这 样的做法有意义吗？ 在美洲，人们都担心帝王蝶的严重减少。虽然 草甘膦除草剂的广泛使用对帝王蝶并没有害，但是 该除草剂的确能杀死帝王蝶主要的食物之一马 利筋，它一般生长在喷施了草甘膦的田地中 。因 此，我对反转人士的建议是，可以培育抗草甘膦的马利筋，并让农民们将其种植在田边。当然到最后，这 很可能是一个坏点子。但是，我觉得反转人士与其 担心抗除草剂性状如何产生，不如把更多的注意力 放在对抗除草剂性状或者某块地域的某种作物（或 杂草）的利弊分析上。 妄言转基因作物可能适合大规模的农业种 植，不适合发展中国家的小农 年世界粮食首脑会议对食品安全是这样 定义的：当世界上所有的人随时都有充足、安全、营 养的食物来维持健康有活力的生命时，才算达到了 食品安全。世界卫生组织认为食品安全的含义有三 个层次： 食品可供应性：有维持生存足量的食物； 食品来源的多样性：有满足各种营养需求的 足够的食物来源； 食品可利用性：在维持基本营养和保健的基 础上对食物合理的使用，就如同有充足的水和公共 卫生设备一样。 显而易见，针对转基因作物能否改善食品安全 中的任何讨论都必须集中在一点上，也是最重要的 一点食品的可得性，也就是要发展高产的作物。 但是，另外几点也同样重要，那就是我们应当考虑作 物的营养价值！因为许多人不仅缺少食物，还缺乏 微量元素的摄入，最典型的是缺铁、锌和维生素 。 至于食物的来源，需要强调的是在发展中国家还要 重视农业生产者的盈利与否。棉花就是一个很 好的例子，它虽然未直接增加食物的供应量，但是能 间接增加农民经济收入从而使他们获得更多的食 物。和 近期的研究证实，在印度，种 植棉花的小农户相比种植其他品种的农民收入 有所增加，他们获得了更多的食物，间接地提高了食 品安全性。使许多人吃惊的是，在 年已有 万农民种植转基因作物，其中是贫穷的 小农户，而且他们中很大一部分是在中国和印度种 植棉花 。 妄言转基因作物是食品安全的唯一出路 当然不是！还有许多其他的好方法，比如：分子 育种技术的应用，杂交作物的培育，土壤肥力的提 高，灌溉管理的改善、农艺方式的改良，基础建设（如 公路和电力设施建设）的加强，拉大市场需求，控制 人口增长，建立更好的政策环境，消除贪污腐败。 哪些性状更能显著地提高食品安 全性？ 全球转基因作物