双元表达载体系统VIP

二元表达载体系统二元表达载体系统主要由两部分组成部分为甲基Ti质粒，这种Ti质粒缺失T-DNA区域，完全丧失了引起肿瘤的作用，主要是Vir基因编码表达Vir蛋白的功能，Vir基因编码的virD2蛋白相当于转移作用因素， 识别农杆菌转座子DNA(T-DNA )的两端24bp序列，进而在单链切断T-DNA的同时，VIR基因编码的virE2与单链T-DNA结合形成t复合体，在原位序列的作用下通过宿主细胞T4SS转运系统进入宿主细胞质。 其后在宿主细胞的转移过程中，激活位于反式位置的T-DNA的转移。另一部分为迷你Ti质粒(Mini-Ti plasmid )，在T-DNA左右边界序列之间提供了NPTII基因和Lac Z基因等植物选择标记。构建二元载体系统的原理是Ti质粒上的Vir基因能够反向激活T-DNA转移。共同合成载体的不同之处在于，不依赖于两个质粒之间的同源序列，可以在农杆菌内独立复制而无需共同合成过程。原理1 .一组常见的植物表达载体，每组有两个，一个是具有可插入外源表达基因的MCS和筛选标签的融合蛋白(通常为GFP或Gus )的常见载体。 另一个载体是二进制载体。 通常，我们将外源基因插入带有筛选标记的载体中，然后将该载体上的所有35S promoter-expression gene-gfp部分切除构建子克隆，其过程是将上述片段插入二元载体的LB和RB之间然后，将具有35S promoter-expression gene-gfp的二维载体转化为农杆菌，通过农杆菌转染植物，最后通过农杆菌特有的ti-DNA转染机制转化为二维载体的Li 我以前使用的是pCAMBIA3101 pUC-35S-GFP、pZPZ211和pAA等2 .二元表达载体系统，主要有两部分3 .部分是辅助Ti质粒，这种Ti质粒因缺失T-DNA区域而完全丧失肿瘤作用，主要是ir基因功能4 .其他部分为迷你Ti质粒(Mini-Ti plasmid )，在T-DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如NPTII基因和Lac Z基因等。 5 .构建二元载体系统的原理是Ti质粒上的ir基因可以反激T-DNA转移。 共同合成载体的不同之处在于，不依赖于两个质粒之间的同源序列，可以在农杆菌内独立复制而无需共同合成过程。 6 .外源DNA克隆到微Ti质粒tDNA左右边界序列之间二元载体标签：植物二元表达载体根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )是一种革兰阴性土壤细菌，通过感染植物伤口，可以移植Ti质粒上含有植物激素和蛋白质合成酶基因的DNA，将其整合到植物受体的基因组中。 Ti质粒中两个独立区决定DNA转移和整合： T-DNA区(transferredDNA )和vir区(virlence region )。 基于Ti质粒的这一结构特征，1983年Hoekema等人提出了将去除肿瘤基因的T-DNA区从Ti质粒中分离出来，置于农杆菌和大肠杆菌可复制的梭菌质粒中的二元载体策略。 该梭载体称为二元Ti载体。 vir区存在于去除tdna的Ti质粒中，农杆菌作为辅助质粒，通过逆活化将tdna转移到植物细胞基因组中。 由于二元Ti载体体积小，基因克隆操作非常方便，逐渐被其他形式的Ti载体取代，成为植物基因工程中最重要的植物转化载体。(1) )病毒载体系统：植物病毒是植物病毒作为植物遗传转化载体系统的感染特性决定了。 以病毒为载体的表达系统是一种瞬时表达系统，一般不能将外来性荆棘因子融合成植物细菌细胞基因组。 植物病毒感染率高，短时间内可获得大表达量。 我们有病毒因为身体表达系统必须针对每种宿主材料接种病毒载体，所以瞬时表达系统很难开始。作为病毒载体的病毒最好是双链DNA植物病毒。 现在自己有十几种植物病毒被改造成不同的种类型外源蛋白表达载体：包括花椰菜叶病毒(CaMV )、烟叶病毒(TMV )、菜豆叶病毒(CPMV )和马铃薯x病毒(PVX )等。 其中至少有在TMV载体上成功的外来病毒150多种。(2)农杆菌质粒载体系统：质粒载体系统中最常用的质粒是：Ti质粒和Ri质粒。 r质粒存在于根癌农杆菌(AgrobacteRium tumcfaciens )，ri质粒存在于根发农杆菌(在Agxobacerium tlhixogenis上。 r质粒和Ri质粒在结构和功能上有很多相似之处，具有荃本一致的特性。 但在实际工作中，大部分采用五质粒。 农杆菌质粒是能够实现DNA转移和整合的天然系统。 r质粒包括两个区域：T -DNA区域(质粒上植入植物受体的基因组，通过在植物细胞中表达，产生冠状消瘦瘤，通过减数分裂能够传递给子代的区域)和Vir区域(编码能够实现TDNA转移的蛋白质)。 TDNA长度在1224kb之间，两端分别有包含25hp重复序列的边界序列，综合过程中左右边界序列之间的TDNA可转移到宿主细胞基因组进行综合，只有边界序列需要DNA转移，边界序列之间的TDNA与转化过程无关，因此外源遗传Vir区位于TDNA以外的35kb，其产物向TDNA的转移和整合是必不可少的。 农杆菌感染植物首先吸附在植物表面的伤口上，受伤植物分泌的酚类小分子化合物可诱导Vir基因的表达。 Vir产物可以在Ti质粒中诱导新的TDNA单链分子。 该单链分子脱离五质粒后，与场r产物VIRD2蛋白共价键合，在V RD4和V IRE等蛋白的帮助下可以从农杆菌进入植物细胞的染色体。 由于野生型Ti质粒过大，约为200s00kb，为便于DNA的重组操作，研究人员改造了Ti质粒，构建了一系列合适的Ti衍生物载体。 首先去除野生型Ti质粒TDNA区的DNA片段。 例如：与生长素和细胞分裂素基因有关(这些基因过度表达植物激素，破坏受体细胞和激素产量)。 另外，需要在t质粒中添加E. Coli复制开始部位，将插入了外源基因的r质粒作为梭状载体，不仅可以通过农杆菌进行复制，而且使用E. Coli的重组操作和保存也变得容易。 3甲植物转化载体系统，包括单载体系统和二元载体系统。 研究发现，在tdna转移过程中，明r基因不一定与tdna位于同一质粒上，通过构建中间载体解决了t质粒不能直接导入目标基因的困难。由于大肠杆菌具有与农杆菌高度结合转移的特性，研究人员可以将T -DNA片段克隆到大肠杆菌质粒中，插入外源基因，最后通过结合转移将上原基因导入农杆菌的Ti质粒中。 这是预先将子克隆、切除、插入、置换的T -DNA导入Ti质粒的有效方法。 具有重组TDNA的大肠杆菌质粒的衍生物载体称为“中间载体”(intermediate 4wtor )，接受中间费希的Ti质粒称为森林“等震t质粒”(aevenfor T nlasmid )。 在此omc-载体中丢失的T DNA部分被大肠杆菌的常见质粒pBR322代替。 适于克隆pBR322质粒的外源DNA片段可以如此与pBR322质粒DNA同源重组，并被整合到oneti质粒载体中。 中间载体通常是多拷贝的B. coli小质粒，对于体外操作导入外源基因是非常必要的。 从结构特点来看，可以分为两种中间载体33，360，即共聚中间载体和二元中间载体。根据两种中间载体，目前两种转化系统：中的一种是单元载体系统(综合载体系统)，这种载体系统由一个综合系统中表达载体和改造的受体卫生质粒组成。 农杆菌内通过同源重组将外源基因整合为改变的TDNA，形成可穿梭的共整合载体，通过Vir基因产物的作用完成目标基因向植物细胞的转移和整合。 但是，这种方法构筑困难，整合体形成率低，一般不怎么使用。另一个转化系统为二元载体系统，由：微r质粒(mini1plasmod )和辅Ti质粒(helper Ti plastnid )构成，TDNA和Vir基因为含有TDNA和Vir区相容性变异的Ti质粒微Ti质粒是TDNA边界缺失Vir基因的r质粒，是一种广谱质粒。 包括广寄主范围质粒复制起始位点(oriv )，具有选择性标记基因。 辅助质粒是含有Vir链段但缺失了TDNA的突变型质粒，完全丧失了肿瘤的功能。 因此，相当于在共集成载体系统中去除甲质粒。 其作用是提供Vr基因功能。 激活相反位置的TDNA转移。 将微细胞移植到含辅助Ti质粒的农杆菌中的另一种方法是直接转化经纯化的微Ti质粒快速冻结的根癌农杆菌受体细胞：种，包括小型Ti质粒的E. Coli，辅助质粒pRK2013 三细菌混合后产生菌问的结合传导。 pRK2013可以移植到农杆菌中，但由于它不能自主复制而丢失，当它们移植到含有微Ti质粒的E. Coli中时