分光光度法检测蛋白质含量

.,生物化学与分子生物学实验,曾季平生物化学与分子生物学系,.,生物化学与分子生物学实验,实验室规则实验室安全及防护实验室常用玻璃仪器实验考试,.,实验室规则,提前5分钟到实验室，不能迟到、早退、旷课，每迟到、早退一次扣1分，每旷课一次扣5分。禁止在实验室内吃食品，如有违反者按迟到处理。上课必须穿隔离衣，不能穿拖鞋和吊带背心，否则禁止进入实验室。实验期间手机必须设置在振动上，上课期间如急需接、打电话请到走廊上处理。在实验室内要保持安静，不得嬉闹、大声说话。认真预习认真做实验养成良好的实验习惯（实验中、实验结束后）值日生工作,.,实验室安全及防护,预防火灾预防中毒外伤,.,实验室常用玻璃仪器,吸量管*(示教)试管烧杯量筒,.,实验考试,实验课成绩,平时表现实验测验原理实验报告-格式结果操作考试分析,.,实验报告网上提交,实验报告采取网上提交的方式，实验报告提交时间设定为3天，即本次实验结束后第三天晚上12点之前提交，过期无法再提交，本次实验报告则记为0分。尽早提交报告，不要等到最后期限，有时系统不稳定，可能提交不上去。直接将报告粘贴在框中，切记不要以附件方式上传，否则有可能文件打不开，影响成绩。不要相互抄袭，一旦发现雷同卷则均记为0分。若过期没有提交报告，不要将报告发到老师邮箱，发也没用，最终实验报告成绩只记系统导出的成绩。,.,实验一,分光光度技术及蛋白含量测定,.,理论掌握分光光度技术的基本原理了解分光光度计的基本构造实验:利用分光光度技术进行蛋白质含量测定1.双缩脲法测定蛋白质含量2.考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量3.紫外分光光度法测定蛋白质含量,.,一、概念利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。应用：定性、定量优点：灵敏度高精确度高操作简便、快速,分光光度技术（Spectrophotography）,.,二、工作原理物质对光线有选择性吸收作用。每种物质都具有其特征性的吸收光谱。在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质的浓度成正比。,分光光度法所使用的光谱范围：200nm10m200400nm400760nm76010m紫外光区可见光区红外光区,.,如何定性？利用吸收光谱曲线鉴定化合物,吸收光谱曲线：以不同波长的单色光作为入射光，测定某一溶液的吸光度，以波长为横轴，吸光度为纵轴作图，得到溶液的吸收光谱曲线。,每种物质有其特征性的吸收光谱，故可作为定性分析的依据。,吸光度,.,1.朗伯（Lambert）定律一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的厚度增加呈指数减少。I1/I0=e-K1l2.比尔（Beer）定律一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的浓度的增加呈指数减少。I1/I0=e-K2CI0:入射光强度；I:透射光强度；l：介质厚度C：介质浓度,如何定量？Lambert-Beer定律*,.,3.Lambert-Beer定律*,一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和溶液厚度成正比。A=CLA：吸光度；C：溶液浓度；L：液层厚度：即摩尔吸光系数，指一定波长时，溶液的浓度为1mol/L，光程为1cm时的吸光度值。*在波长、溶液和温度确定的情况下，由物质的特性决定的。,.,4.计算*（1）标准管法（标准比较法）实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。A标准=标准C标准L标准A样品=样品C样品L样品A：吸光度；：摩尔吸光度；C：溶液浓度；L：液层厚度,.,因标准液和样品液中溶质为同一物质，样品=标准因盛标准液和测定液的比色杯径长相同L样品=L标准故上二式可写成：A标准/A样品=标准C标准L标准/样品C样品L样品C样品=A样品/A标准C标准,.,（2）标准曲线法绘制标准曲线：配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度。以溶液浓度为横座标，吸光度为纵座标，在方格座标纸上作图得标准曲线。获取样品的浓度：根据测得样品的吸光度值从标准曲线上获得测定物的浓度。,.,标准曲线使用注意事项,标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。吸光度在0.051.0范围内。所作标准曲线仅供短期使用。标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行，避免误差产生。,.,5应用中注意的问题*Lambert-beerslaw的偏离：该定律只适应于一定浓度范围，A宜在0.051.0之间；选择波长：最大吸收波长；a.灵敏；b.避免杂质干扰参比溶液（空白管）：消除背景效应，应包含除待测溶质以外所有的成分。,.,空白管：测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零，既消除比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，所测值即为待测物造成的光吸收。,.,分光光度计(spectrophotometer),一基本部件,.,.,二、分光光度计使用步骤（示教）三、使用时注意事项*1.波长选择。2.机器预热。3.不测量时，应使样品室盖处于开启状态，否则会使光电管疲劳。4.不应把成有腐蚀性液体的比色皿放在仪器表面。,.,5.比色皿使用注意事项*由于紫外光不能透过玻璃比色皿，紫外光区测量时要用石英比色皿。同组使用的比色皿必须配套（规格、新旧程度一致）。比色皿有2光面与2毛面，光学表面对准光路，不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加。,.,比色皿中所盛溶液不能太少，也不能太多，一般所盛液体约占全部容积的2/3。腐蚀性溶液不得长期盛放在比色皿中。每次使用后,应立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水冲洗比色皿34次。*本次实验，考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着色，酒精浸泡后清洗。,.,蛋白质定量分析实验,实验一双缩脲法测定蛋白质含量（p50）实验三考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量（p52）实验四紫外分光光度法测定蛋白质含量（p53）,.,实验一双缩脲法测定蛋白质含量,【基本原理】蛋白质分子中含有许多肽键，与双缩脲结构类似，在碱性溶液中能与铜离子结合成紫色的化合物（称双缩脲反应）。在一定浓度范围，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的含量。含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。双缩脲法的灵敏度为1-20mg。,.,【操作步骤】,（一）标准曲线的绘制1.取小试管6支，编号按下表操作,2混合后，于37水浴中放置15分钟，在540nm波长下比色，以第6管调零，测得各管的吸光度值。以各管的吸光度值为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘成曲线。,.,（二）样品测定：取样品0.1ml，加生理盐水0.9m1，再加双缩脲试剂4m1，于37水浴中放置15分钟，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线并计算得出样品中蛋白质的浓度。注意：,双缩脲法的灵敏度为1-20mg，取蛋白标准液时注意浓度。实验时，样品管可与标准管同时处理,.,【基本原理】考马斯亮兰G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质可通过范德华力结合，与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大吸收峰从465nm变成595nm，能过测定595nm处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。优点：灵敏度高，1-5g；测定速度快；干扰物质少。,实验三考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量,.,1取试管3支，编号按下表操作试剂（ml）空白标准标本生理盐水0.1蛋白标准液(50ugml)0.1样品0.1考马斯亮蓝试剂5.05.05.0,2.混匀，放置5分钟，在波长595nm处，以空白管调“0”，测定各管的吸光度。,【操作步骤】,.,3.计算A标本/A标准50（g/ml）=样品中蛋白质的含量（g/ml）注意：蛋白标准液浓度50g/ml,.,实验四紫外分光光度法测定蛋白质含量,【基本原理】由于蛋白质分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸，因而蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm波长处。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波长范围内，吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，可作定量测定。灵敏度：50-100g,.,【操作步骤】,（一）制作标准曲线1.取试管6支，编号，按下表操作。试剂（ml）123456标准蛋白质溶液0.51.01.52.02.50生理盐水3.53.02.52.01.54.0混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第6管调“0”，在280nm波长下测定各管光密度，以各管的光密度值为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线图。（二）标本测定：取标本1.0ml，加入生理盐水3.0ml，测A280标准曲线上读出浓度。,.,颈椎脱臼处死小鼠，剪开腹部，取出肝脏组织，置于平皿中用PBS清洗。称取100mg肝组织，剪碎，并转移到匀浆器中。将1