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03.06.2020、1、流式细胞仪、03.06.2020、中国科技大学生命科学实验中心、2、流式细胞仪是进行流式细胞仪分析的仪器，是电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论一体化的非常先进的检测装置。 03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，3，流式细胞仪特征，在分析单个细胞的同时，多参数分析速度快： 10000个细胞/秒统计学意义：提供细胞群体的平均和分布情况筛选感兴趣的细胞，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心， 4、流式细胞仪原理流式细胞仪应用流式细胞仪数据处理03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，5，流式细胞仪工作原理，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，6， 流式细胞术(FlowCytometry，简称FCM，也称为FACS )是一种能够快速、准确、客观地同时测量单个微粒(通常为细胞)多个特性的技术，同时能够筛选特定群体的研究对象为生物粒子，例如各种细胞、染色体、微生物、 人工合成微球等研究微粒的特性包括各种物理特征和生物学特征，包括定量、工作原理，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，7，流式细胞仪结构，流式细胞仪光学系统激光光源光采集系统电子系统光电转换数据处理系统03.06.2020， 中国科技大学生命科学实验中心，8，InjectorTip，Fluorescence，signals，Focusedlaser，beam，Sheathfluid，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，9，细胞做了特殊标记所使用的标记细胞探针是能够与筛选对象细胞表面的特征蛋白质(抗原)结合的抗体，该抗体也能与某种荧光染料结合。 结合的细胞带有荧光标记。 经稀释的细胞进入超声波振荡器后，极少见的细胞悬浮液形成小液滴，一个液滴中只含有一个细胞。 通过液滴形成的激光束，激光束激发与细胞表面结合的抗体分子。 03.06.2020、中国科技大学生命科学实验中心、10、荧光染料及其发光波长、FITC525nmPE575nmPI630nm自发荧光和特异荧光、03.06.2020、中国科技大学生命科学实验中心、11、抗体的选择，直接标记抗体的荧光分子PE最强， 弱表达抗原FITC适用于最便宜的强抗原间接标记：一般不提倡，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，12，实验对照设计，空白对照： ALL阴性对照：常用同型抗体对照单色分析：同型对照多色分析：同型对照，单阳性对照(仪器校正用) 阳性对照：检测阴性时，采用03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心13，实验标本处理，单细胞悬浮液制备：胰酶消化抗体或标记分子染色：抗原抗体反应非特异性结合去除：清洗与关闭：与血清同型抗体，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心14， 流式细胞仪的样品要求，单细胞悬浊液的被检细胞或粒子大小0.2-80um的样品中至少20000个细胞浓度105-107个/ml，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，15，流式细胞仪的光学系统，激光(Laser ) 是一个相干光源，单一波长，单向，同步稳定的激光波长：台式机可提供488nm、635nm的激光波长，主机波长光谱线宽325、457.9、488、514.5、520.8、530.9、568.3、633和635nm的紫外线UV光采集系统由几个透镜、滤光镜、小孔构成，将发生的光信号导入检测器，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，16，ForwardAngleLightScatter，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，17， 90degeelightscatter 03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，18，DichroicFilter/Mirror，Filterplacedat45o，Reflectedlight，TransmittedLight，light sot 中国科技大学生命科学实验中心，19 Laser，fluorescenceincedetectors，pudueuniversitycytometrylboratories，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，20，流式细胞仪光学系，03.0 经过聚焦整形的光束垂直照射在样本流上，被荧光染色的细胞通过激光的照射而产生散射光和激发荧光。 这两种信号同时被前向光电二极管和90向光电倍增器接收。 向前以较小的角度检测光散射信号，该信号基本上反映细胞体积的量值的荧光信号的接收方向与激光束垂直，经过一系列二色性反射镜和带通滤波器的分离，从而形成多个不同波长的荧光信号。 03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，22，1流式细胞仪散射光信号，FSC:表示细胞尺寸SSC :细胞内粒子复杂度，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，23，外全血球散射光二参数点图(溶解红细胞后)， 03.06.2020中国科学技术大学生命科学实验中心，24，2，荧光信号、荧光素吸收激光能量的荧光素吸收放出能量，转化为振动能量和热能，与比入射光波长长的光量子荧光素特异抗体结合的荧光抗体与细胞抗原结合，产生的荧光信号越强03.06.2020、中国科技大学生命科学实验中心25、流式细胞仪电子系统信号检测和分析的细胞带有荧光素标记物，通过激光照射区域被激发，产生不同波长的代表细胞内不同物质的荧光信号被光电接收器接收， 被转换为电信号，能够分析电压脉冲的高度、面积和宽度的电脉冲信号被A/D转换为数字信号，然后被发送给计算机，进行存储、制图、统计分析，03.06.2020中国科学技术大学生命科学实验中心，26， 当包含细胞的液滴一个一个地通过激光束时，如果由两个检测器检测出的：液滴中包含细胞，则干涉检测器(interferencedetector )被激活，仅具有荧光标记细胞的液滴被激活荧光检测器(fluorescencedetector ) 带荧光标识的液滴通过激光束时，两个检测器同时激活，引起液滴充电信号使鞘液带负电荷。 由于液滴带负电荷，移动后会移动到正电位，进入荧光标记细胞的陷阱。 的双曲馀弦值。细胞筛选原理，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，27，流式细胞仪筛选系统，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，28，流式细胞仪的应用，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，29， 流式细胞仪科研应用细胞表型分析细胞内细胞因子的检测染色体分类研究细胞周期和DNA多倍体分析流式细胞仪细胞内钙离子测定，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，30，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，31，howtoanall ，Antigen(cytokines )，FluorescenceDetectorantibody，CaptureBeads，Captureantibody，beads，03.06.2020，中国科学技术大学生命科学实验中心MultiplexedBeads，Shadesofacolor，Antibodycoupledbeads，emitingatdistinctfl3intensities，varousanalysistes AntibodycoupledPElabel，emittingatfl2intensityproportonaltanalystecon .03.06.2020，中国科学技术大学生命科学实验中心，33，beadsprovideaflexibleplatfl Multiplesizes，beadsrovideanexpandableassayplatformforusewithaflowcytometer，Differentintensities，differecolorswithdifferenties 03.06.2020中国科学技术大学生命科学实验中心，34，Example6-beadassay，CaptureBeads，LysateorSupernatantSample，DetectorAntibodies 中国科学技术大学生命科学实验中心， 35 CBAStandardcurves，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，36，流式细胞术临床应用，白血病免疫分型HLA-B27:强直性脊柱炎淋巴细胞亚群造血干细胞数：造血干细胞移植网红细胞PNH诊断(CD55，CD59 )血小板活化试验， 03.06.2020中国科技大学生命科学实验中心，37，流式细胞仪数据处理，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，38，数据处理，检测数据显示测量参数的差异可从多种形式中选择。 单参数数据以直方图的形式表现，其x轴为测量强度，y轴为细胞数。 对于双参数或多参数数据，可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维三点图、等高线图、灰度图或三维立体图。 03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，39，流式细胞仪数据分析(1)，直方图分析，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，40，流式细胞仪数据分析(2)，点图分析，03.06.2020， 中国科技大学生命科学实验中心，41，流式细胞仪数据分析(3)，等高图和密度图分析03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，42，Gating，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，43，Compensation，03.06.2020， 中国科技大学生命科学实验中心，44，Compensation，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，45 03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，46，G0-G1，s，G2-M，FluorescenceIntensity，# of ever atpyicaldnhosotiogramofcellproliferation， 03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，47细胞凋亡检测技术，一个概念2技术和方法，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，48，1荧光信号面积：积分荧光光束，2DNA指数(DI ) :相对DNA含量的3倍体： 2倍体，4倍体，倍体， 含非整倍体的非二倍体，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，49，凋亡细胞特征，形态上早期核固缩，染色体聚集在核膜内侧，新月体，核崩解细胞浆和细胞器密度增高，细胞体积减小，细胞膜皱纹卷曲，但早期细胞膜完整性细胞坏死后，细胞肿胀，FSC增大，SSC也增大，03.06.2020，中国科技大学生命科学实验中心，50，AnnexinV/PI二染生细胞(