引物设计技巧及优化_生工生物技术讲座

PCR引物与探针设计引物与探针设计 曹霞 上海生工 曹霞 上海生工 目录目录 背景背景 1 引物设计与分析的软件引物设计与分析的软件 2 DNA合成及常见问题合成及常见问题 3 引物设计及合成网址和邮箱引物设计及合成网址和邮箱 4 背景背景 ?PCR原理 ?引物设计流程 实验鉴定 引物评估 引物设计 PCR类型确定 基因序列查找Step by step ?基因的查找基因的查找 ? 进入NCBI 主页：/search 后面 选择Gene，在for 后面填写需要查找的基因的名字。如图 所示： ?点击“Search”，出现以下界面： 选择 gene 输入基因名称 基因的全称 基因的物 种来源 ?点击序列1的DDR1出现页面如下图所示（部分页面）： ?设计引物之前知道需要确定设计引物之前知道需要确定PCR类型类型 ?普通PCR ?SNP鉴定 ?Real-time PCR ?RT-PCR ?荧光定量探针荧光定量探针 ?引物的作用（基因获得、测序、检测等）引物的作用（基因获得、测序、检测等） ?引物设计与分析软件引物设计与分析软件 ?引物设计软件 Primer 3 plus Oligo 6.22 Premier 5.0 Primer Express 3 ?引物分析软件 Primer 5 Oligo 6.22 Primer-Blast ?引物设计需考虑的问题引物设计需考虑的问题 ?引物长度: 太短低的特异性，结果可导致非特异性扩增。 太长在退火时，可能导致与模板结合效率低，发卡结构 的发生。 ?合适长度： 18-24 bp适合普通PCR扩增。 30-35 bp适合多重PCR扩增。 ?产物大小： 300-1000 bp适合普通PCR，避免 3 kb 50-150 bp适合real-time PCR，避免 400 bp ?引物设计需考虑的问题引物设计需考虑的问题 ? 序列Tm值:上下游引物的Tm值（melting temperature）是 寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50 %寡核 苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值 510 。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的 Tm值。 ? 合适的Tm值： 52 - 60 。 65 以上避免。 75 - 80 来扩增高GC含量的片段。 ? 上下游引物Tm值的错误： 上下游引物Tm值错误，可能导致扩增失败。 上下游引物Tm值相差最好 6.0）或TE缓冲液（ PH 7.5-8.0），开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000 转/分钟 的转速下离心1 分钟，防止开盖时引物散失。 ?合成的引物应如何保存? 没有溶解的引物非常稳定，可以在-20下保存至少1年， 溶解好的引物可以事先稀释为100moL/L的储存液，分装 数份保存于-20冰箱，可以保存至少半年以上（反复多次 冻融会降低使用寿命）。使用前，将浓溶液稀释成工作液 （10 pmol/ul或20 pmol/ul）后进行实验。 ?上海生工公司可以合成多长的序列？ 由于用户和基因拼接的要求，我们很好地合成过不少100 碱基左右长度的长片段。因为我们可以提高起始合成数量 、加大合成用的试剂量、用PAGE纯化。如果您的实验需 要，我们愿意接受110碱基以下的订单。 ?如何将两条互补的单链退火形成双链？ 用退火缓冲液(10 mM Tris, pH 7.5 - 8.0， 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合，总 体积不要超过500 微升，加热到95 2 mins，然后缓慢冷 却至室温(低于30 )即可。退火的产物可以放在4 待用 。 ?合成的引物5端是否有磷酸化？ 合成的引物5为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用 多核苷酸激酶进行5端磷酸化，或者要求我们合成时直接 在5或3端进行磷酸化，需要另外收费。 ?2OD的引物可以多少做次PCR反应？ 一般来讲，20个碱基左右的2OD的引物最少可以做400次 PCR反应。 ?引物在常温下运输，会降解吗？ 不会降解，干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上 。而一般的运输时间通常都在1-3天，所以收到的引物不会 降解。 ?不同纯化方法的应用： 产品用途纯化方法 ULTRAHAPULTRAPAGEHPLC 普通PCR 多重PCR或定量PCR 点突变或克隆 基因合成 化学或物理应用 修饰或标记DNA ?适用网址 http:/www.bioinf ormatics.nl/cgibin /primer3plus/prim er3plus.cgi. 设计与比对 引物网址 http:/www.ncbi.n /tools/ primerblast/index. cgi?LINK_LOC= BlastHome Primer3Plus Primer- Blast 引物设计及合成网址和邮箱引物设计及合成网址和邮箱 ?