微接触印刷技术在表面图案化中的应用

第 20卷第 6期高分子材料科学与工程 Vol. 20,No. 6 2004年 11月POLYMER M ATERIALS SCIENCE AND ENGINEERING Nov. 2004 微接触印刷技术在表面图案化中的应用 冯 杰 , 高长有 , 沈家骢 (浙江大学高分子科学与工程学系 , 浙江 杭州 310027) 摘要: 综述了微接触印刷技术在表面图案化中的应用 ,包括在金表面、玻璃表面以及聚合物表面制备物 理、化学性质不同的图案化微区 ,以及这些微区在生物大分子微阵列、细胞选择性粘附及功能调节、表面 浸润性研究等领域的应用。着重介绍了“经典”微印刷技术及最新发展状况 ,特别是在非模型的生物材料 表面的应用。 对影响微印刷技术成功的因素也进行了简要分析。 关键词: 微接触印刷;图案化 ;自组装单分子层;生物大分子 ;细胞生物学 中图分类号: Q71 文献标识码: A 文章编号: 1000-7555(2004)06-0001-05 1 前言 随着现代科学技术的发展 ,表面微构建技 术已引起了人们广泛关注。 从光学平板印刷 1 到溶液亲疏性自组装 2, 3,再到新近发展起来的 “软刻”技术 4 7 ,无一不推动了材料表面技术 的深刻变革 ,其中最为出色的当属微“软刻”中 接触印刷 ,简称“ CP ”技术 8。该技术由 White- sides于 1994年首次提出 ,并获得了快速发展。 CP能够在微米、亚微米级尺寸上微图案化材 料表面性质和结构 ,能够实现小分子、聚合物、 生物大分子 ,以及细胞在材料表面的选择性吸 附 或 粘 附 , 因 而 对 生 物 传 感 器 (生 物 芯 片 ) 9 11、组织工程12及细胞生物学基础研 究 13 15都具有重要意义。 较之传统的光学平板印刷技术 , CP因成 本低 ,工艺简单 ,无须苛刻的实验室环境 ,可实 现非平面表面图案化等优势受到了化学家、生 物学家的普遍重视 ,成为研究材料 - 细胞相互作 用、生物配体 - 受体特异性识别以及生物芯片制 备新技术的有力工具。本文重点介绍了 CP技 术在生物材料表面微构建中的作用 ,对影响此 技术成功的因素作了简要分析。 2 CP技术及其应用 2. 1 弹性软印章制备 Fig. 1 Schematic illustration of the procedure used to fabricate a PDMS stamp 在一洁净、平整的玻璃或硅表面旋涂光刻 胶 ,然后在光掩模 ( Mask)下紫外曝光显影 ,制 得一面含有特定图案的底模 Master,再在其上 浇铸二甲基硅氧烷预聚体 ( PDMS) ,交联固化 后即得含有反衬图案的弹性软印章 16 ( Fig. 1)。其图案大小决定于 Mask上图案的大小 ,深 度则由光刻胶的浓度及旋涂时的转速来调节。 在这一过程中 ,光刻仅用来构建底模 ,制得的 Master可以重复使用近 20次 , PDMS软印章 也可以使用近 100次。 PDMS因其良好的生物 相容性 ,一定的气体渗透性 ,光学透明 ,以及出 色的弹性和可等离子体表面处理等性能 ,成为 收稿日期: 2002-11-25;修订日期: 2003-01-30 基金项目: 国家重点基础发展研究规划 ( 973)资助项目 (G1999054305) 作者简介: 冯 杰( 1973- ) ,男 ,博士生 . 联系人: 高长有. Email:cygao 弹性软印章材料的首选 17。 2. 2 用 CP技术形成图案化的 SAM CP技术最早用于在金表面图案化移印 硫醇 ,形 成图案化的硫醇自 组装单分子层 ( SAM)。 这一创新技术成为研究细胞 - 材料相 互作用的理想工具 ,因为改变硫醇末端功能基 团的特性 ,就可以获得不同的 SAM微区 ,从而 不仅可以探索哪些材料对细胞粘附生长有利 , 哪些材料不利 ,还可以详细研究材料表面究竟 如何与细胞相互作用等细胞生物学基本问题。 将镀有金膜的基底放到烷基硫醇 ( RSH)的溶 液或蒸气中 ,可在金表面形成 RSH的 SAM 18。 Sigal等人 19研究了一些蛋白质对含不同末端 基团 SAM表面的非特异性吸附 ,发现蛋白质在 不含电荷表面的吸附同表面亲水性及蛋白质分 子的大小有关 ,小尺寸的蛋白分子仅可吸附在 亲水性最差的表面 ,大一些的蛋白分子则可在 一定程度上吸附在所有的表面。 末端为乙二醇 低聚物的烷基硫醇的 SAM则可完全阻止蛋白 质吸附 20。CP技术是将表面含有微图案的弹 性 PDMS印章用烷基硫醇的乙醇溶液浸涂 ,然 后晾干 ,再与金表面无缝接触 10 s 20 s,烷基 硫醇只被转移到 PDMS与金表面相接触的微 区形成 SAM。 未被 SAM覆盖的裸露的其它地 方则可继续吸附上含另一种末端基的烷基硫 醇 ,从而形成图案化的 SAM 16。 利于和不利于 蛋白质吸附的 SAM,当与CP技术相结合后 , 蛋白质的表面图案化固定以及细胞的选择性粘 附就成为可能。 2. 3 经典 CP技术及在细胞生物学方面应用 2. 3. 1 图案化固定生物大分子: 所谓经典CP 技术 ,特指用 CP和 SAM技术相结合 ,在金、玻 璃或硅等基底表面构建图案化功能微区 ,研究 生物大分子图案化固定、细胞选择性粘附及材 料 - 细胞相互作用的一类技术的统称。 含有不同末端基团的图案化的 SAM可用 来控制蛋白质的吸附。 L pez等人 21用微印刷 技术在金表面图案化形成以低聚乙二醇 ( PEG) 和甲基为末端基的 SAM微区 ,并把此图案化的 SAM 浸入各种蛋白质溶液 ,如纤维粘连蛋白 ( Fn)、纤维蛋白原、丙酮酸激酶、链霉抗生物素 蛋白以及免疫球蛋白等的溶液 ,结果发现这些 蛋白都吸附在以甲基为末端基的 SAM微区。 Zhang等人 22合成了一种低聚多肽 ,该多肽的 N端含有一细胞粘附基序 , C端为一半胱氨酸 残基 ,半胱氨酸中的硫醇基团使得整个低聚多 肽分子在金表面形成 SAM。用CP技术即可在 金表面图案化地形成含细胞粘附基序的微区和 PEG微区 (排斥蛋白质吸附 )。 Yan等人 23将含有羧基末端基的 SAM表 面用三氟乙酸处理 ,获得含链间酸酐的 SAM表 面 ,再用 CP技术将含有氨基的配体图案化固 定在这些活泼表面 ,最终形成配体-SAM表面 共价结合 (通过酰胺键 )。 这种先构建含反应活 性末端的 SAM表面 ,再通过CP技术连接特定 配体 ,最终形成该配体图案化的方法简单省时 , 无需费时费力地合成含配体的硫醇分子。 同时 因所用的硫醇分子含有 PEG链段 ,又能有效阻 止蛋白质的非特异性吸附。 2. 3. 2 图案化粘附细胞及相关研究: 许多哺乳 动物细胞是锚定依存的 ,它们必须粘附并铺展 在一定基底上才能生存。细胞外基质 ( ECM)蛋 白如 Fn 、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白等能够促 进细胞在基底表面的粘附 ,单纯的细胞粘附多 肽如 RGD等也有同样效果 24。 用微印刷技术 图案化 SAM,可获得蛋白质的选择性吸附 ,从 而能够实现细胞的定域甚至定点粘附。 不仅如 此 ,改变“粘附岛”的尺寸和形状 ,还可相应地控 制细胞的大小和铺展形态 ,进而研究细胞形状 对其生长、分泌及凋亡的影响。 Mrksich等人 25用CP技术在金或银表面 形成以 PEG和甲基为末端基的图案化的 SAM, 当在基底物上涂敷 Fn后 ,牛毛细血管内皮细胞 ( BCE)仅粘附在以甲基为末端基、粘有 Fn的 SAM微区。 Singhvi等人 13用CP技术在一基底物上 图案化形成层粘连蛋白的岛 ,其余部分为非粘 附区域 ,然后将新生鼠肝细胞种植在该海- 岛样 结构的表面上。 结果显示: 细胞优先粘附在层粘 连蛋白覆盖的岛上 ,而且多数情况下 ,细胞的铺 展形状与岛的形状一致。 粘附岛尺寸对肝细胞 的生长和分化功能存在相反方向的影响。 即随 粘附岛尺寸下降 ,细胞生长速率逐步降低 ,但白 蛋白分泌能力却呈上升趋势。 在非图案化表面 可自由伸展 ,因而 DNA合成旺盛 ,但却迅速丧 失分泌大量白蛋白的能力。 这说明细胞的形状 2 高分子材料科学与工程2004年 能够控制细胞的生长与蛋白质分泌。 Chen等人 26, 27用微图案化基底来控制人 和牛毛细血管内皮细胞 ( HCE/BCE)的形状。 发 现当细胞被粘附在 Fn的小岛上时 ,它仍然有活 泼的向非粘附区 ( PEG末端区 )伸展的倾向 ,即 先是向外伸展几微米进入非粘附区 ,几分钟后 又快速收回。但是 ,当粘附岛的间隔小于 20 m ( 10 m)时 ,人 (牛 )内皮细胞间即可形成“搭 桥”现象 ,从而不能单独培养。 研究还发现 ,随 ECM 岛尺寸的下降 ,细胞从生长 ( DNA复制 ) 转向凋亡。 进一步研究则证实是细胞的伸展程 度而非粘附面积控制着细胞的生存和凋亡。 Mikos等人 28用 PDMS软印章直接移印 十八烷基三氯硅烷 ( OT S)于处理过的玻璃表 面 ,形成 OTS的连续微区及隔离的圆形“玻璃 岛” ,用人视网膜色素上皮细胞 ( RPE)评估了这 一化学图案化表面对细胞粘附、生长、形态及细 胞骨架取向的影响。 发现微图案化表面影响细 胞的初始粘附率 ,限制细胞的伸展 ,促进特征的 方形细胞形态的形成。种植密度为 30, 000 cm- 2 时 ,细胞在图案化表面能保持正常的肌动蛋白 和细胞角蛋白表达 ,而在非图案化的玻璃表面 , 细胞则呈现类成纤维细胞样形态 ( Fig. 2)。再次 证明了可用 CP技术控制细胞的形态 Fig. 2 Scanning electron micrographs of RPE cells adhering to ( a) 10 m and ( b) 50 m circular paterns and ( c) glass control for 4 h, the initial cell seeding density was 30000 cell /cm2, scale bars are 10 m 和正常表型。 2. 4 用 CP技术直接移印生物大分子 微印刷技术不仅可以在模型表面构建图案 化 微 区 , 也 可 以 在 组 织培 养 级 聚 苯 乙 烯 ( TCPS)、玻璃或处理过的硅表面直接移印蛋 白质等生物大分子。 由于这些材料具有良好的 透明性和较低的成本 ,为相关研究带来了很大 的方便 ,如检测技术等 ,也成为生物芯片的首选 载体材料。 Bizios等人 29用CP技术在酸处理 过的玻璃片表面直接移印层粘连蛋白 - 多聚赖 氨酸复合物。研究发现 ,鼠海马趾神经细胞只选 择性地粘附到含有层粘连蛋白 - 多聚赖氨酸的 窄条上 ( 2. 6 m) ,粘附的神经细胞形成很长的 轴突并精确地顺着这一连续窄条方向伸展。 这 说明神经细胞对层粘连蛋白有高度的选择性 , 其图案化的表面为神经轴突的伸展提供了有效 的长程诱导 ,预示着先进的、基于神经细胞的微 器件的发展是可行的。 Offenha usser等人 30用 CP技术在非组 织培养级 PS表面图案化移印层粘连蛋白 ,精确 定位神经细胞并诱导其分化。详细考察了 ECM 微区尺寸与形成的神经网的形状的关系 ,成功 地定位了 PCC7-MzN神经细胞 ,获得了可控的 神经元极化条件。 Bernard研究证明 31,用CP 技术可在 1 s之内 ,精确地实现蛋白质、脂质双 分子层等生物大分子从软印章到基材 (如玻璃、 硅、 TCPS等 )的转移。 即将蛋白质溶液浸涂到 未处理的 PDMS上 ,在 PDMS表面形成蛋白质 的均匀单层 ,然后冲洗、干燥 ,迅速微移印于基 材表面。 移印后的蛋白质图案 ,不仅具有较高的 相差和清晰度 ,而且仍能保持生物活性 ,这是 CP技术的一个重要特征。 与其它微阵列方法 相比 ,CP技术的主要优点在于它可以“一次 性”地获得较大的生物活性表面 ,并且具有较高 的清晰度。 蛋白质也可通过高清晰喷墨打印机 和 点样机 (细金属针管或电雾化 )实现微阵 列 32 ,但当沉积后的液体样干燥后 ,却难以保 证良好的图案效果 ,蛋白质容易集结 ,同时容易 失去生物学活性 31。 2. 5 CP技术用于聚合物表面 无论是 SAM模型表面 ,还是 TCPS表面 , 它们都难以应用于组织培养材料或移植材料 , 更重要的是可能导致不希望的生物排斥反应。 因此 ,如何将CP技术用于生物材料就成为其 3 第 6期冯 杰等: 微接触印刷技术在表面图案化中的应用 发展的主要方向。 Chilkoti等人 33发展了CP 技术 ,提出“反应性” CP 。 具体是先将聚对苯 二甲酸 乙二醇 酯 ( PET )表面 羧基化 , 再用 PDM S移印含氨基的生物素配体 ,由于羧基与 氨基的反应 ,即得到图案化的生物素配体。这证 明生物分子的微图案化不仅局限于金、硅表面 , 在聚合物表面也可以实现相同质量的微构建。 该法对难以物理吸附到聚合物表面的生物分子 如小分子生物配体、多肽、寡聚核苷酸等的图案 化固定特别有效。最近 , Hammond等人 34又提 出“聚合物到聚合物” 一种实现表面化学图 案化的通用方法。该法把经典的 Layer-By-Lay- er法和CP技术相结合 ,在含有电荷的基底表 面图案化移印带相反电荷的共聚物或一般聚电 解质 ,从而得到正、负相间或亲、疏相间的化学 图案化表面。 该法可以在带电玻璃、硅、金属及 聚合物表面实现化学图案化。 除了上述两种方 法外 , Mikos等人 35还另辟溪径 ,在 PLGA表 面直接移印 PEG/PLA嵌段共聚物 ,利用物理 作用力获得特定的化学图案化表面。 细胞培养 结果表明 ,这一图案化表面影响 RPE细胞的初 始粘附率 ,限制其铺展 ,促进特征的方形细胞形 态的形成。 这表明在生物降解聚合物表面也可 以实现微图案化并控制细胞的形态 ,就为 CP 技术在组织工程领域的应用奠定了基础。 尽管有诸多优点 ,但据我们的研究体会 , CP技术并非完美无缺。 主要是在表面微移印 时图案重复性较差。 影响因素较多 ,有些尚难以 控制 ,因此 ,分析研究这些影响因素是十分必要 的。 3 影响微印刷成功的关键因素 3. 1 PDMS印章特征尺寸 PDM S印章表面必须有足够的图案深度 和垂直度 ,才能保证较高的移印质量。 对在金表 面移印小分子硫醇 ,要求深 2 m以上; Offen- ha usser 31用深 12. 5 m的 PDMS移印层粘连 蛋白; Mikos35移印 PLA-PEO共聚物时 ,所用 PDM S图案更是深达 50 m。 3. 2 溶液浓度及浸润性 移印物质的溶液必须具有合适的浓度及良 好的浸润性 ,保证在 PDM S表面形成均匀的单 层。 溶液在 PDMS表面浸涂不充分 ,或充分但 不均匀 ,均将导致图案失真 34。 一般对低分子 量物质在 2 mmol /L 10 mmol /L,生物大分子 可根据重复单元数不同控制在 20 g /mL 50 g /mL。 在移印蛋白质时 ,可对 PDM S表面进 行等离子体处理以增加溶液浸润性。 3. 3 接触压力 必须使用足够的压力以确保印章与基底接 触良好。 对硫醇在金表面、硅烷在玻璃表面的移 印 ,一般使用 10 kPa 15 kPa的压力 ,移印蛋 白质等“软”材料于 PS表面 ,接触压力常在 5 kPa 6 kPa左右。压力不足导致所得图案不清 晰 ,这对反应性CP尤其重要。 3. 4 接触时间 接触时间对移印物从 PDMS表面转移到 基底表面很重要。 硫醇在金表面反应 ,可在几秒 之内完成 ,蛋白质在基底表面的移印也如此。 但 对反应性CP,则根据界面反应活性不同 ,保持 10 min 20 min不等。 研究发现 ,接触时间过 久也会导致图案失真 34。 3. 5 干燥和冲洗 浸涂溶液后 PDMS的干燥和移印后的基 底的冲洗也很重要。 溶液一般要用惰性气体如 氮气缓慢吹干。 基底一般使用超声波清洗或相 应溶剂冲洗以去掉多余或物理吸附的移印物。 对用反应性 CP图案化接枝物理吸附性强的 物质 ,这一点尤为重要 ,否则难以界定是物理吸 附还是化学反应上去的。 可见 , CP法是一项 工艺简单但操作细致的技术 ,实际使用时 ,务必 综合考虑各种因素 ,反复摸索工艺条件 ,以获得 最佳效果。 在同一实验中保持这些参数的一致 性 ,才能获得较好重复性。 4 展望 综上所述 ,CP技术是一种简单、灵活、高 效的表面图案化蛋白质及细胞的方法 ,同时因 成本低、清晰度高、无须苛刻的实验室环境而受 到化学家和生物学家的普遍重视。 该法与微流 道网络技术 36、基于膜的微图案化法 ( MEM- PAT) 37 ,以及大面积的微井构建方法 17等技 术一起 ,构成了生物器件、组织工程及细胞生物 学研究的基础平台。 在生化实验微型化如高效 药物筛选、高并列 ELISA检测 31以及神经组织 工程等方面有着巨大的发展前景。 4 高分子材料科学与工程2004年 参考文献: 1 Bhatia S K, Hickman J J, Lig ler F S.J. 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