微生物发酵生产谷氨酰胺转氨酶的研究进展_王齐

综述讲座 微生物发酵生产谷氨酰胺转氨酶的研究进展 王齐宋小平王雅洁蔡晶晶李光伟 【摘要】 谷氨酰胺转氨酶( TG) 是一种催化酰基转移反应的转移酶， 它可使蛋白分子间和分子内产 生共价交联， 从而改变蛋白的功能特性， 在食品工业具有重要的潜在应用价值。为了实现工业化生产 TG 目的， 文中综述了近年来国内外在谷氨酰胺转氨酶菌株的选育、 发酵条件的优化和分离提纯等方面的进展 情况。 【关键词】 谷氨酰胺转氨酶; 菌株的选育; 发酵条件的优化; 分离提纯 Latest advance of research on transglutaminasesmade by microbial fermentationWANG Qi，et al Department of Biochemistry，Anhui Medical College，Hefei，Anhui 230601，China 【Abstract】 Transglutaminase ( TG) ，the enzyme catalyzing the reaction of the acyl transfer，generates inter and intramolecular covalent crosslinking between proteins so as to change the functional characteristics of the protein，therefore the enzyme have important potential applications in the food industry In order to achieve the purpose of industrial production of TG，the paper covers the latest advance in the fermentation conditions optimization of TG Strain and the separation and purification of the enzyme 【Key words】 Transglutaminase; Strain screening; Fermentation condition optimization; Purification 谷氨酰胺转氨酶( Transglutaminase， 简称 TG， EC2， 3， 2， 13) ， 是一种催化酰基转移反应的转移酶。由于其具有在蛋 白质间架桥形成 - ( - Glu) - Lys 的异型肽键 1 ， 将蛋白质共 价交联聚合， 使蛋白质改性， 该酶已经在食品工业、 医药工业、 分析检测和生物工程等方面取得广泛应用， 因而具有很大的 研究开发空间 1- 3 。 近年， 国内外关于 TG 在食品工业应用的报道较多， Claucia F 等 2 报道在亚马逊河附近筛选到一株产谷氨酰胺 转氨酶的菌 BL32， 经 TG 处理的酪蛋白、 大豆分离蛋白和水解 动物蛋白的自由氨基减少， 并对酪蛋白显示出明显的蛋白质 交联作用， 与 Martin P 等 3 研究 TG 对酪蛋白的蛋白质交联 作用结论一致。姜燕等 4 以大豆分离蛋白、 酪蛋白酸钠等蛋 白质为原料制备蛋白膜， 研究了 TG 对各种蛋白膜的溶解特 性和体外消化率的影响， 发现 TG 的作用不仅使大豆分离蛋 白膜、 酪蛋白酸钠膜和乳清蛋白浓缩物膜的水分含量和总可 溶性物质量明显降低， 而且显著降低了蛋白膜的消化率。鉴 于该酶在食品工业的广泛应用， 本文简要综述国内外微生物 发酵法生产 TG 的研究进展。 一、 产谷氨酰胺转氨酶菌株的选育 在微生物发酵生产 TG 的开发中， 获得优良菌种是最关 键的因素之一。发酵生产 TG 所用菌种中最为常见的是链轮 丝菌属放线菌， 但该属放线菌在自然界中分布不普遍， 分离时 遇到的很少， 加之文献资料对有关菌种来源及筛选技术方案 等均无公开， 因此， 菌种的筛选技术方案的研究就显得十分重 基金项目: 安徽省教育厅自然研究重点项目 “茂原链轮丝菌补料 分批发酵生产谷氨酰胺转氨酶培养基的优化及代谢通量分析” ( 编 号: KJ2010A201) 作者单位: 230601 合肥， 安徽医学高等专科学校生物化学教研室 ( 王齐) ， 生物制药教研室( 宋小平、 王雅洁、 蔡晶晶) ; 230022 合肥， 中 国科技大学生物工程中试基地( 李光伟) 要。王璋、 王灼维等根据产酶微生物自身特性和酶催化反应 结果的特征性质， 首先设计了一个从土壤中筛选 TG 生产菌 株的技术路线， 有针对性地采集各种典型土样， 利用廉价的酶 作用底物开展蛋白质交联凝絮一沉淀性能测定试验方法来作 为初筛手段， 获得了一系列生产 MTG 的微生物菌株。进而对 其进行了分类鉴定， 定名为链霉菌( streptomyces sp ) WZFF W- 12 等，酶活为 0 24 U/ml5 。接着， 他们对菌株 WZFF W- 12 的孢子进行亚硝基胍( NTG) 单独和结合经胺复合进行了 多次诱变， 再经初筛分析和复筛验证， 获得了一系列产酶性能 良好、 遗传形状稳定的 TG 高产突变株， 最高的酶活相对提高 了近 7 96 倍 6 。为了进一步提高 TG 生产菌株的总体性能， 王璋等 5- 6 将常规诱变方法选育出的菌株以孢子悬液组、 PDA 培养斜面组、 无机盐斜面培养组和 NTG 诱变组等四种方 式送上了 “神舟” 四号无人船进行空间搭载诱变育种。研究 结果表明， 6 株搭载突变株的酶生产能力比对照提高了 40%。 二、 微生物谷氨酰胺转氨酶发酵条件的优化 工业化规模生产 TG， 除筛选产酶活力高的菌株外， 研究 菌株产酶的最佳培养基和环境条件也是非常重要的。 1 营养条件对微生物谷氨酰胺转氨酶发酵过程的影响: Claucia Fernanda Volken de Souza 等 7 研究用天然的玉米粉， 去壳的糙米， 大豆废渣、 豆壳、 制糖糖渣固态培养 BL32 菌株 产 TG 酶， 发现在富含蛋白质和半纤维素的大豆废渣上生长 的菌株产 TG 酶活最高， 培养 48 h 后每克干物质上酶活达 0 74 U， 并提出可以使用经济廉价的工农业废渣固体发酵生产 TG 酶的思路。黄六容等 8 通过摇瓶发酵试验研究不同碳源 和氮源对 H- 197 菌株生物量与产酶的影响， 认为葡萄糖是最 适产酶碳源， 以葡萄糖为碳源时细胞生长最好， 同时酶活也最 高， 其生物量和酶活分别为 18 60 g/L、 0 55 U/ml， 其次是麦 芽糖， 生物量和酶活分别为 18 42 g/L、 0 46 U/ml。常中义 等 9 研究了不同的碳源对轮枝链霉菌 SK- 2 产 TG 的影响， 结 237齐齐哈尔医学院学报 2013 年第 34 卷第 5 期Journal of Qiqihar University of Medicine， 2013， Vol34， No5 果发现甘油是最有效的碳源。进一步研究发现 SK- 2 产 TG 受碳源分解代谢物的阻遏， 而添加油脂可以解除碳源分解代 谢物的阻遏效应， 提高菌体产酶。在各种油脂中， 以添加 0 4 %橄榄油效果最好， 可使酶活达到 7 89 mol/ml。 2 环境条件对微生物谷氨酰胺转氨酶发酵过程的影响: 温度和 pH 值是影响 TG 发酵的重要环境条件之一。Claucia Fernanda Volken de Souza 等 2 运用中间复合设计试验( CCD) 结合二阶多项式回归数学模型研究了通气量、 温度、 pH 值和 接种对固体发酵生产 TG 的影响， 结果表明通气量 0 6 L/ min， 温度 33 ， pH 值在 5 7 8 7， 接种量为 10log10CFU g 1， 酶活达 1 16 U/g， 且酶活非常稳定; 而且 Ca2 + 和 Mg2 +浓 度分别达到 2 mol/L 和 1 mol/L 时， 显著地提高了酶活和稳定 性。郑美英等以 Streptoverticillium mobaraense 为出发菌株， 研 究了培养中温度控制策略， 得出 TG 发酵过程中温度控制策 略为: 0 18 h， 控制温度为 32 ， 18 h 后将温度切换到 28 。 采用此温度控制策略在 2 5 L 小罐上进行 TG 发酵， 酶活比未 控制温度时的最好水平提高了 14%， 发酵时间也缩短了 6 h10- 12 。 由此可见， 采用合理的温度和 pH 控制策略确实能够显 著提高 TG 的发酵过程中的各项指标。 三、 微生物谷氨酰胺转氨酶的分离提纯 TG 产品的生产根据实际需要分为粗酶制剂的提取制备 和纯化产品的提纯精制。酶制剂的粗提主要采用硫酸铵盐析 法， 发酵液离心弃去菌体后的上清液经过超滤浓缩器处理后 得到超滤浓缩液， 再经过各浓度硫酸铵的盐析沉淀得粗酶液， 透析后真空干燥得粗酶产品。透析后的部分粗酶样液先后以 CM Sepharose CI 6B 弱酸性阳离子交换树脂柱层析和 Blue Sepharose CI 6B 凝胶过滤柱层析分离， 并分别进行透析和 Amicon Ultra 超滤浓缩后冷冻干燥等系列纯化处理， 可获得纯 化 120 倍以上的高精度酶制产品13 。Luis Henrique de Barros Soares 等 14 研究了 TG 的分离纯化方法， 将发酵液在 2 、 15 000 g 离心 15 min 后弃沉淀， 上清液经硫酸铵分级沉淀， 收集 活力最高的沉淀组分并悬于 20 mM、 pH8 0 的 Tris- HCl 缓冲 液中。该样品透析除盐后， 上 Q Sepharose Fast Flow 柱， 用 0 1 0 MNaCl 梯度洗脱， 收集活性组分。再将收集到的样品 上 Octyl- Sepharose 4FF 柱， 用含( NH4) 2SO4的 Tris- HCl 缓冲 液进行梯度洗脱， 收集活性组分。经过上述方法得到的 TG 酶经 SDS- PAGE 检测呈清晰的单一条带， 相对分子量约为 45 000 Da。国内方面， 鲁时瑛等 15 对发酵液进行抽滤、 超滤、 乙 醇溶析、 冻干后得到粗酶， 粗酶经过 CM 纤维素层析和 Sephadex G75 凝胶过滤后可获得较纯的酶， 平均酶活收率为 40%， 纯化倍数约为 5。 结论本文综述了在筛选谷氨酰胺转氨酶高产菌株、 优化发酵条件和改进分离提纯工艺方面的进展， 鉴于目前人 们对微生物中 TG 的生物合成途径及其在微生物体内的代谢 调节机制尚不完全清楚。因此， 在分子水平上进行代谢调控， 进一步提高产量还存在一定困难， 但是利用酶学修饰和改造 等方式获得高效、 底物特异性广的 TG 将是未来研究的热点。 参考文献 1Motoki M，Seguro K Transglutaminase and its use for food processing Trends in Food Science Technology， 1998 ( 9) : 204- 210 2Claucia Fernanda Volken de Souza，Janaina Guimares Venzke， SimoneHickmannFlres， etalEnzymaticpropertiesof transglutaminase produced by a new strain of Bacillus circulans BL32 and its action over food proteins LWT- Food Science and Technology， 2011( 44) : 443- 450 3Martin P， Bonisch， Manfred Huss， et al Transglutaminase cross- linking of milk proteins and impact on yoghurt gel properties International Dairy Journal， 2007( 17) : 1360- 1371 4姜燕， 唐传核， 温其标， 等 酶法改性对各种蛋白膜的溶解特性 和体外消化率的影响， 2009， 35( 3) : 71- 73 5王璋， 王灼维， 莫湘筠 微生物谷氨酰胺转胺酶生产菌株的育 种研究 中国生物工程杂志， 2003， 23( 6) : 1- 5 6王灼维， 王璋 土壤分离转谷氨酰胺酶生产菌株 食品与发酵 工业， 2003， 29( 4) : 5- 10 7Claucia Fernanda Volken de Souza ， Julio Xandro Heck， Marco Antonio ZachiaAyub Solidstatebioreactorproductionof transglutaminase by Amazonian Bacillus circulans BL32 strain Microbiol Biotechnol， 2008， 35: 1677- 1685 8黄六容， 何冬兰， 刘梅芳 产谷氨酰胺转胺酶菌株的筛选及其 产酶条件研究 华中农业大学学报， 2005， 24( 4) : 369- 372 9常中义， 江波， 王璋 培养基组成对轮枝链霉菌合成谷氨酰胺 转胺酶的影响 无锡轻工大学学报， 2001， 20( 1) : 51- 54 10郑美英， 堵国成， 陈坚 发酵生产谷氨酰胺转胺酶的摇瓶条件 无锡轻工大学学报， 1999， 18( 3) : 37- 41 11郑美英， 堵国成， 陈坚， 等 分批发酵生产谷氨酰胺转胺酶的温 度控制策略 生物工程， 2000， 16( 7) : 759- 762 12郑美英， 堵国成， 陈坚， 等 pH 值和初始淀粉质量浓度对发酵 生产谷氨酰胺转胺酶的影响 无锡轻工大学学报， 2000， 19