大肠杆菌感受态细胞的制备

.,大肠杆菌感受态细胞的制备,.,实验目的,1.熟悉感受态细胞制备原理。2.掌握大肠杆菌感受态细胞制备的方法。,.,.,实验原理,在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。经一定的理化方法诱导后，处于适于摄取和容纳外源DNA的细胞，称为感受态细胞。,.,目前，制备感受态细胞已成为基因操作的常规技术。感受态细胞:原核细胞或真核细胞。特点：细胞的通透性在制备过程中增强使其易于接受外源基因。细胞本身应为修饰、限制酶缺陷的菌株，使外源DNA分子不易被切除或破坏。,.,制备感受态细胞可以使用电击法或化学法。电击法是利用瞬时高压电流处理细胞悬浮液，使细胞膜发生去极化，产生微孔，悬液中的核酸就可通过微孔进入细胞。电击转化需要仪器帮助化学法则更加简便，尤其适用于原核细胞感受态制备。,.,大肠杆菌感受态制备：RuCl法CaCl2法其原理是细胞在低温，低渗CaCl2（0.1M）作用下，会发生膨胀，Ca2+使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导细胞成为感受态细胞。转化时混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，通过热刺激，液晶态细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入细胞。,.,操作步骤,细菌接种与培养取-70冰冻大肠杆菌DH5菌种，用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于37培养过夜。第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3mlLB培养液的试管中，37振荡培养过夜。次日取菌液30L接种至含有3mlLB培养基的试管中，37剧烈震荡培养约23小时（200300r/min）。,.,菌体收集当菌落600nmOD值达到0.30.4时，将试管取出放置冰上1015分钟。在无菌条件下，取1ml菌液装入1.5ml离心管中。4,5000rpm离心5min。弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。,.,制备感受态(1)加200L冰预冷的0.1MCaCl2到离心管中，振荡混匀，使菌体悬浮，冰浴30min。(2)4,5000rpm离心5分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上，吸干残留液体。(3)加50L冰预冷的0.1M的CaCl2，重悬浮菌体，放至4保存备用，2448小时内使用效果较好。如果暂时不用，可加入等体积的30%的甘油（甘油终浓度为15%），混匀。液氮速冻后保存于-80低温冰箱中待用，可保存半年以上。,.,注意事项,细胞的生长状态和密度最好从-70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已多次转接，或贮存在4的培养菌液。应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液OD600控制。DH5菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5107个/ml左右，过高或不足均会使转化率下降。,.,注意事项,防止污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头