RNAi慢病毒稳转细胞和原核表达简介

Novobio Custom Services,C,1,第一部分 RNAi服务,2,RNA干扰现象是1990年由约根森（Jorgensen）研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的研究中发现的,1998年，安德鲁法厄（Andrew Z. Fire）等在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中进行反义RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA显示出了更强的抑制效果,RNAi干扰机理,3,长链,三种RNAi干扰技术手段,4,RNAi的应用,高通量的研究基因功能基因敲除基因治疗基因表达调控,5,1.1 siRNA合成服务,化学合成的siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。,6,偌百优势 siRNA oligo均由HPLC纯化，100除去尚未配对的单链多种修饰选择：末端修饰（FAM，Biotin等），碱基修饰（2-OMe）,7,化学合成优势 操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。,服务流程,客户提供：siRNA oligo的序列信息或相应的靶基因信息（便于设计），以及技术要求（包括OD和nmols的精确数量、纯化类型、修饰要求等）根据序列信息，进行化学合成；HPLC纯化；经过分光光度计精确定量冻干处理我们提供：长度19-23碱基/链的siRNA，产品形式为退火的双链RNA的冻干粉，有以下选择普通siRNA化学修饰siRNA利用2-Fluoro或2OMe修饰以提高siRNA在血清和培养基中的稳定性；作用时间长于普通siRNA；荧光标记siRNAsiRNA对照，包括普通阴性对照（与目的靶细胞中所有基因无同源性的阴性对照）、荧光标记的阴性对照（方便在荧光显微镜下观察转染的效率，有利于优化转染条件）和siRNA阳性对照（作为一个实验系统检查，确保在实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的；常用的siRNA阳性对照有LaminA/C，Beta-Actin，P53，GAPDH等）,8,1.2 RNAi载体构建服务,使用RNAi载体的优势实现瞬时或稳定的靶标抑制在任何类型的细胞（甚至是难转染的细胞、原代细胞和非分裂细胞）中执行 RNAi通过诱导型RNAi表达来调控基因抑制选择稳定表达RNAi序列的纯细胞群通过组织特异性启动子控制体内基因表达,9,三种载体构建方式,shRNA干扰载体构建：miRNA（microRNA）干扰载体构建shRNAmir干扰载体构建,10,shRNA expression vectors,11,利用miRNA产生RNAi效果,诺百优势,质量保证：针对一个基因的不同位置设计4条miRNA序列，在转染效率80%的前提下，我们保证至少有2个克隆可以达到至少70%转录水平的knockdown。多种平台载体可供选择：shRNA载体，miRNA干扰载体（第二代干扰载体），miR-shRNA载体（第三代干扰载体）利用绿色荧光蛋白（GFP）和感兴趣的RNAi序列协同表达，方便追踪可将多个RNAi序列串联到同一表达载体中并同时表达，进行多个靶基因的同时干扰,12,服务流程,客户提供：基因的Accession Number针对特定基因，设计RNAi序列；合成该序列并退火生成双链DNA将DNA与RNAi载体相连，连接物转化大肠杆菌测定全长序列以鉴定序列的正确性；制备甘油菌提供数据分析和报告给客户我们提供：构建好的RNAi表达载体和相应的甘油菌,13,1.3 RNAi干扰服务,在RNAi研究中，测定敲除效率时，通过转染控制的最适化，可以获得高敲除效果。因此，为了将RNAi研究成功导入，需要对客户希望的细胞进行转染效率的最适化工作。我们采用实时荧光定量PCR或免疫蛋白印迹法分析这些RNA干扰序列对靶基因蛋白表达水平的抑制的有效性,14,诺百优势质量保证：针对某靶基因设计的3条siRNA可保证其中两条的Knockdown效率达到70%（在转染效率大于80%的情况下）；针对某靶基因的4条miRNA序列，在转染效率80%的前提下，我们保证至少有2个克隆可以达到至少70%转录水平的knockdown。可针对客户选择的靶细胞系，进行转染条件的优化服务，以确定所选择的细胞系的有效转染条件。,15,服务流程,客户提供 选择的细胞系和详细的细胞培养的操作步骤；选择的靶基因cDNA的序列号；抗体（如果需要Western blot检测）对需要用于转染的细胞进行细胞培养对需要用于转染的细胞进行细胞培养；优化转染条件：在荧光显微镜下检测Fluorescent Oligo或可表达GFP的干扰载体的荧光强度，评估转染效率为靶基因设计一组siRNA双链或干扰载体采用荧光定量RT-PCR或免疫蛋白印迹评估转染后某一时间点靶基因RNA水平或蛋白水平的变化可利用抗生素来筛选稳定表达shRNA或miRNA的细胞株我们提供：转染效率分析；Knockdown分析，包括实时荧光定量PCR检测、Western Blot图片等,16,第二部分 慢病毒的制备和慢病毒RNAi干扰服务,17,| Life Technologies Proprietary & Confidential | 4/19/2011,Why need viral vectors?,难转染细胞动物实验,Invitrogen Proprietary & Confidential,Invitrogen病毒表达系统,瞬时表达腺病毒稳定表达慢病毒,慢病毒表达系统源于HIV,1983年法国科学家发现HIV； 2008年获诺贝尔生理医学奖,| Life Technologies Proprietary & Confidential | 2/13/2018,弗朗索瓦丝巴尔西诺西,吕克蒙塔尼,Life Cycle of HIV/lentivirus,| Life Technologies Proprietary & Confidential | 2/13/2018,Pluta et al， 2009,Applications of Lentiviral Vectors,Gene delivery into cells Animal transgenesisClinical gene therapyGenome-wide functional studies of gene expression/knockdown,| Life Technologies Proprietary & Confidential | 2/13/2018,Application I Gene delivery into cells,| Life Technologies Proprietary & Confidential | 2/13/2018,Application II Animal Transgenesis,Implemented successfully in mice，rats, pigs, chickens, cows, domestic cats, prairie voles, primates, etc.Higher transgene expression level Better survival rateCan be tissue-specific and/or conditional expression,| Life Technologies Proprietary & Confidential | 2/13/2018,Anti-HIV therapy (2001. Hum Gene Ther. 12: 2028-2029.)CNS: neurons, astrocytes, adult neuronal stem cells, oligodendrocytes, and glial cells(2008. Curr Gene Ther 8: 461473; 2006 Mol Ther 13: 484493; 2006. Hum Gene Ther 17: 19.)Liver, Heart, Pancreas ( 2006. Clin Sci. 110:37-46)Kidney, muscle (2004. Mol Ther 10:768-779)Vaccine (2009. Vaccine 27:3443-3449; 2008. PLoS One 3: e3973),| Life Technologies Proprietary & Confidential | 2/13/2018,Application III Clinical Gene Therapy,Application IV - Genome-wide Functional Screening,| Life Technologies Proprietary & Confidential | 2/13/2018,Ali etc. 2009. Blood. Lentiviral RNAi library to screen gene targets capable of altering cell differentiation and proliferation,Invitrogen Proprietary & Confidential,Invitrogen ViraPowerTM HiPerformTM vectors,cPPT (from the HIV-1 integrase gene) increases the copy number of lentivirus integrating into the host genomeWPRE enhances protein expression,DEST vectorEmGFP for expression tracking andcell sorting,DEST vectorBlasticidin for stable selection,Invitrogen Proprietary & Confidential,How the ViraPower Lentiviral Expression System works,Gag/polRequired for packaging,RevAdded safety feature,VSV-G envelopeBroad Tropism,Optimized ViraPower Packaging Mix,The Rev protein recognizes the RRE element in the viral RNA; thus, Rev makes sure that the viral RNA (unspliced viral mRNA) is exported into the nucleus.The Gag protein recognizes the Psi element in the viral RNA; thus, only viral RNA is packaged and no other mammalian RNA.The expression of the gag-pol sequence is rev dependent, thus preventing the expression of gag-pol in the absence of rev.,Invitrogen Proprietary & Confidential,Lentivirus Packaging,Step 1: Co-transfect retroviral packaging vectors and pLENTI6.3/V5 vector with gene of interest into 293FT cells.,pLP1,pLenti6.3-GOI,pLP/VSV-G,pLP2,293FT Cells,Invitrogen Proprietary & Confidential,Lentivirus Packaging,pLP/VSV-G,pLP1,pLenti6-GOI,pLP2,Step 2: Viral rev protein exports the viral RNA genome (carrying the gene of interest) out of the nucleus.Envelope protein is made and becomes studded in the cells membrane.pLP1 and pLP2 make gag/pol and rev. In the nucleus, Pol transcribes pLenti into viral RNA (5 LTR-3 LTR).Rev transports the viral RNA w/ goi from nucleus to cytoplasm. Rev recognizesthe viral RNA via its RRE (Rev response element).,Rev,goi,goi,Rev,Gag Pol,Envelope protein,Invitrogen Proprietary & Confidential,Step 3: Viral gag proteins package the gene of interest and infectious viral particles bud out of the cell.In the cytoplasm, viral RNA (goi) is combined with the Pol protein. This packaged complex goes to the plasma membrane and buds off, picking up the envelope on its way out (pseudotyping).,Gag Pol,Lentivirus Packaging,Invitrogen Proprietary & Confidential,Lentivirus Packaging,Step 4: The supernatant is collected and titered. The viral particles created are replication incompetent viral particles that are capable of stably delivering a gene of interest.,Invitrogen慢病毒侵染细胞实例一,慢病毒侵染原代细胞-子宫平滑肌瘤细胞的荧光和明视野照片对照,Invitrogen慢病毒侵染细胞实例二,慢病毒侵染一种干细胞(荧光和明视野照片对照),慢病毒侵染人脐静脉原代细胞(荧光和明视野照片对照),| Life Technologies Proprietary & Confidential | 2/13/2018,慢病毒侵染人脐静脉原代细胞(荧光和明视野照片对照),Invitrogen慢病毒侵染细胞实例三,慢病毒滴度测定,36,10-2,10-3,10-4,10-5,10-5,37,诺百优势质量保证：如无特殊要求我们将提供至少1 ml含107-108病毒颗粒的病毒液。去除了病毒的关键蛋白，对人体安全；属于复制缺陷型病毒，不会产生下一代病毒颗粒；已被改造为自身失活性，病毒转导并整合到细胞后不再具有产生具有包装能力的病毒基因组。可根据需要选择组织特异性或细胞特异性启动子,38,客户提供：含有目标基因的质粒（提供测序图谱）或所要表达的目的基因的名称，序列；所需要的病毒滴度及总量，病毒是否需要纯化；若需要检测外源基因的表达，如需要请提供相应的抗体我们提供：提供重组后的慢病毒载体质粒，并附上对目的基因的PCR鉴定结果；提供已测定好滴度、可以直接进行后续分析的慢病毒储存液,39,第三部分 哺乳动物稳定转染细胞系构建服务,40,稳定转染,最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）稳转优势：能够指导蛋白质的正确折叠，提供多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。,41,诺百优势质量保证：可对转染细胞的外源基因表达进行严格鉴定，包括RNA水平和蛋白水平（rt-PCR,免疫蛋白印迹）筛选后可以得到稳定表达外源基因的细胞克隆：质粒DNA整合到染色体上；可使用慢病毒载体转导的实验条件，整合后非常稳定，在传代100次后仍然保留在宿主基因组中，可以克服使用非病毒载体转染方法构建稳定株，成功率低，稳定性差，稳定克隆株易出现不均一(含有非整合细胞)等缺点。不同选择：使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株,4