第二章色谱基本理论

0,第一章输入标题,第二章色谱基本理论,赵龙山,分析化学教研室,1,第一章输入标题,色谱理论,动力学理论,热力学理论,相平衡观点,塔板理论,动力学观点,VanDeemter,动力学因素对色谱峰扩展的影响,色谱流出曲线的形状及其影响的因素,2,第一章输入标题,一、色谱流出曲线和有关概念,1色谱流出曲线是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。,2基线是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。,3,第一章输入标题,一、色谱流出曲线和有关概念,3色谱峰是流出曲线上的突起部分。,正常色谱峰为对称形正态分布曲线。,不正常色谱峰有两种：拖尾峰和前延峰,色谱峰的对称与否：对称因子（拖尾因子）。,对称因子在0.951.05之间的色谱峰为对称峰；,小于0.95者为前延峰,大于1.05者为拖尾峰,4,第一章输入标题,一、色谱流出曲线和有关概念,前延峰：,可能原因为进样体积太大或样品浓度太高（样品过载），平衡破坏，对于流动相来说样品溶剂非极性太强（对于反相柱），柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效；前延峰最常见的原因是样品溶液的离子强度大于缓冲溶液的。影响峰前延的因素很多，包括柱子，柱温，进样浓度，流动相等因素。（1）进样量太大，可以适当降低样品的进样浓度。（2）柱温低，升高柱温。（3）被测物有明显的酸碱性，主要考虑是不是要换流动相体系。（4）样品在溶剂中溶解的不合适，可以使用流动相作为样品溶剂;（5）柱子坏了，检查色谱柱是否塌陷。,5,第一章输入标题,一、色谱流出曲线和有关概念,拖尾峰：,使得数据系统难以准确确定峰的终点，从而影响结果的准确度和精密度。（1）溶解样品的溶剂极性强于流动相而引起的拖尾：第一种就是先流出的峰的拖尾较后流出的峰拖尾严重；第二种迹象就是进样量减少或者是样品经流动相稀释后进样峰拖尾减轻。（2）样品过载，峰的前端会变得尖锐，后端拖尾，保留时间会稍微提前。如果峰形看上去有点像直角三角形，那么可能就是过载了。,6,第一章输入标题,一、色谱流出曲线和有关概念,拖尾峰：,（3）固定相中的硅醇基与胺类相互作用引起的拖尾：在反相HPLC：带正电荷的溶液（胺类）与固定相颗粒表面上的酸性硅醇发生了离子交换而引起的二次保留，而且中性pH（68）条件下比在酸性pH（3）更易发生。在pH3的条件下操作，可使硅胶固定相上的硅醇基质子化，减少了溶质与硅醇反应的几率。还可以在流动相中加入竞争性的胺类，如三乙胺（TEA），TEA可以与硅醇发生强的反应，并抑制样品中的胺类与硅醇反应。酸性和中性的化合物一般不受影响，碱性化合物更易受到影响。,7,第一章输入标题,一、色谱流出曲线和有关概念,拖尾峰：,（4）酸性化合物在硅胶上吸附引起的拖尾：酸类物质有时候引起峰的展宽和拖尾主要由于硅胶固定相的吸附。应提高流动相中盐的浓度来抑制二次反应，降低流动相的pH使硅醇和溶质质子化，必要时可以向流动相中加入竞争性的酸。举例：布洛芬，酸性化合物，严重拖尾，向流动相中加入乙酸可以改善。乙酸优先和硅胶固定相表面的酸性硅醇基反应，抑制了与硅醇基的反应，减低了拖尾。,8,色谱参数,定性参数,定量参数,柱效参数,分离参数,相平衡参数,保留值、相对保留值、保留指数,理论塔板数、有效理论塔板数,理论塔板数、有效理论塔板数,分离度、分离值、分离数,峰高、峰面积,9,第一章输入标题,一、相平衡参数,(一)分配系数,1.分配系数与线性色谱的关系,组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度(c)之比。,分配系数与组分浓度大小无关，其色谱峰呈正态分布-线性色谱。,非线性色谱体系的K不是常数，K随浓度而变化。,分配系数由组分和固定相的热力学性质决定，随柱温而变化，与两相体积无关。,在液相色谱法中，还取决于流动相的性质。,10,第一章输入标题,一、相平衡参数,2.分配系数与柱温的关系,G0-相对于标准状态的组分自由能,R-气体常数,Tc-柱温,一般，温度上升20，K值约下降一半。,11,第一章输入标题,达到分配平衡后组分在固定相和流动相中的质量(m)之比，也称质量分配系数。,Vm-色谱柱中流动相的体积，近似等于死体积V0,Vs-柱中固定相的体积。,一、相平衡参数,(二)容量因子(capacityfactor；k),分配系数和保留因子的关系：,（相比）,12,第一章输入标题,(三)分配系数和保留因子与保留时间的关系,设流动相的线速度为u，组分的速度为v，将二者之比称为保留比：,在定距展开如柱色谱中，v=L/tR，u=L/t0,一、相平衡参数,13,第一章输入标题,（四）分配系数与保留体积的关系,（五）分配系数与比移值的关系,定时展开（TLC）：t=t0，所以：R=R,一、相平衡参数,14,第一章输入标题,（六）色谱分离的前提,分离的前提：,一、相平衡参数,15,第一章输入标题,一个色谱峰可用峰面积、保留时间和峰宽来进行定量、定性和评价柱效。,二、定性参数,1保留时间(tR),是从进样到某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔，即从进样开始到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔。,2死时间(t0),是分配系数为零的组分，即不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间。,3调整保留时间(tR),16,第一章输入标题,保留时间与分配系数的关系,假设，单位时间内，一个分子在流动相中出现的概率为R，若R=1/3,则这个分子有三分之一时间在流动相，三分之二在固定相中。在流动相和固定相中溶质的质量分别用cmVm及CsVs表示：,Vs色谱柱中固定相所占有的体积；Vm色谱柱中流动相所占有的体积，K分配系数,组分的K越大，在色谱柱中的保留时间越长，tR取决于K，而K取决于流动相、固定相以及样品本身的性质。,GC中，K的主要影响因素是柱温，LC中，K的主要影响因素是流动相性质。,17,第一章输入标题,保留时间与容量因子的关系,k表明一个组分在色谱柱固定相中被吸附而多停留的时间是不被吸附组分的保留时间的倍数，倍数越大，说明色谱柱对此组分的保留能力越强，柱容量越大。,K取决于组分、固定相、流动相的性质和温度；而与体积Vs,Vm无关；k除了与物质性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。,18,第一章输入标题,4.保留体积(retentionvolume，VR)：从进样开始到某个组分流出色谱柱达到最高浓度时所需通过色谱柱的载气体积称为该组分的保留体积，样品组分二分之一量被流动相带出色谱柱所需的流动相体积。保留体积、保留时间和载气流速(Fc，ml/min)的关系如下：,二、定性参数,19,第一章输入标题,5.死体积（V0）：是由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间。即为色谱柱中固定相颗粒间间隙（Vm）、进样器至色谱柱间导管的容积(Vit)、柱出口导管(V0t)及检测器内腔容积（Vd）的总和。死体积大，被分离组分扩散，色谱峰展宽，简而言之，死体积就是流动相的体积。死体积与死时间和流动相流速有如下关系：,二、定性参数,20,第一章输入标题,6.调整保留体积(adjustedretentionvolume，VR/)：是保留体积扣除死体积后的体积称为调整保留体积，即组分停留在固定相时所消耗的流动相体积，其表达式如下：,二、定性参数,21,第一章输入标题,相对保留值是色谱分离系统的分离选择性指标。其不等于1是色谱分离的前提。,7.相对保留值(relativeretention；r)指被测组分和参比组分的调整保留值之比。相对保留值的特点是只与温度和固定相的性质有关，与色谱柱及其它色谱操作条件无关。反映了色谱柱对待测组分间的选择性，是气相色谱法中最常使用的定性参数。,二、定性参数,22,第一章输入标题,8保留指数(retentionindex；I),保留值受色谱操作条件的影响严重，通用性差；相对保留值选取标准物质作为参照物，减少色谱条件影响，但分析多组分复杂混合物时，只用一种标准物质来测定其余组分的相对保留值，误差较大。,1958年Kovats提出了保留指数，又称Kovats指数，组分的保留行为，换算成相当于含有几个碳的正构烷烃的保留行为来描述，就是以正构烷烃系列作为量度被测物质相对保留值的标准物，而不是以一种物质作为标准物。,二、定性参数,23,第一章输入标题,通常用两个保留时间相近的待测组分的标准物质来标定待测物的保留指数Ix，公式如下：,Z与Z+n分别代表含有Z与Z+n个碳原子的正构烷烃，n可以为1,2，通常为1.,二、定性参数,24,第一章输入标题,规定正己烷、正庚烷、正辛烷的保留指数分别为600、700、800，依次类推。,同系物中，每增加1个CH2，保留指数增加100。,二、定性参数,25,第一章输入标题,说明该未知物的保留行为，相当于7.756个碳的正构烷烃的保留行为。,通过气相色谱手册查得该未知物为乙酸正丁酯。,二、定性参数,26,第一章输入标题,色谱峰区域宽度,1标准差(standarddeviation；),是正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半，物质的分散程度，小，分散程度小，峰顶点对应的浓度大，峰形窄，柱效高。,标准差是峰高0.607倍处峰宽的一半。,二、定性参数,27,第一章输入标题,（一）色谱峰区域宽度,2半峰宽(peakwidthathalfheight；W1/2),是峰高一半处的峰宽。,3峰宽(peakwidth；W),是通过色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。,二、定性参数,A=1.065(h)(W1/2),30,第一章输入标题,（二）塔板数和塔板高度,1.理论塔板数,理论塔板数取决于固定相种类、性质（粒度），填充情况，柱长，流动相的流速以及测定柱效所用物质的性质。,组分的保留时间越长，、W1/2越小，理论塔板数越大，柱效越高。,二、定性参数,液相色谱中还与流动相的种类、性质有关。,31,第一章输入标题,2.有效塔板数,用调整保留时间计算的为有效理论塔板数。,二、定性参数,32,第一章输入标题,3.理论塔板高度,二、定性参数,4.有效塔板高度,初始分离效果,增加理论板数n,增大相对保留值r,RS=1,RS=2,(1),(2),理论板数与相对保留值的作用,34,第一章输入标题,四、分离参数,分离度（resolution，R）,1.定义,分离度又称分辨率,为了判断分离物质对色谱柱在色谱柱中的分离情况,常用分离度作为柱的总分离效能指标.用R表示.R等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。,二、定性参数,响应,V0,进样,VR3,VR2,VR1,4分离,tR1,tR2,tR,4,4,4,6分离,38,第一章输入标题,一般说当Ruopt）,u越大，B/u越小，Cu越大，Cu起主导作用，u增加，H增高，柱效降低。,70,第一章输入标题,（一）影响板高因素的讨论,1涡流扩散(eddydiffusion)也称为多径扩散,-填充不规则因子,-填料(固定相)颗粒的平均直径,填充柱填充不均匀，组分的不同分子经过多个不同长度流出而导致色谱峰展宽。,填充柱填充越不均匀，A越大，dp越小越好，但dp越小越不易填充均匀，同时柱阻增大，在GC中，一般采用80100目的填料，开口毛细管柱，无多径项，A为零。,71,第一章输入标题,2纵向扩散(longitudinaldiffusion),r-扩散阻碍因子,B-纵向扩散系数或分子扩散系数,Dm-组分在流动相中的扩散系数,Dm与温度成正比，与相对分子质量的平方根成反比；纵向扩散与流动相的线速率成反比。,减小分子扩散,使用较高流速,降低柱温,采用相对分子质量较大的载气,载气线速度小时，用N2,载气线速度大时，用H2,72,第一章输入标题,3传质阻抗(masstransferresistance),Cm与柱内径、形状、填料的性质有关，其值在0.0110之间，是一个无因次的常数。,减少Cs的方法：,（1）降低固定液液膜厚度（2）增大Ds：柱温升高，Ds增大（3）k值对Cs的影响：,73,第一章输入标题,3传质阻抗(masstransferresistance),Cs-固定相传质阻抗系数k-保留因子df-固定液的液膜厚度Ds-溶质在固定相中的扩散系数,当k1时，k增大，Cs减小当k时，Cs0当k=1时，柱效最低当k1时，k减少，Cs减小一般情况下，k1,HAB/CA,B,C分别代表,纵向分子扩散和对总塔板高度贡献的常数.是双曲线方程.H由相互独立的三项加和组成,涡流扩散项HEA与流速无关,与的关系是一条水平直线；纵向分子扩散项HLB/与流速成反比,与的关系呈双曲线；两相传质阻力项:HMHSC与流速成正比.与的关系是斜率为C的直线.,速率理论H图,最佳流速,H图的特征反映了色谱体系的分离特征.,反映了色谱体系的分离特征.u对HL和HMS的影响正好相反.体现在Hu图上有一最低点.这个最低点兼顾了分子扩散和两相传质阻力的抗衡,使两者之和最小.在这点上的H称为最小塔板高度Hmin,u称为最佳线速度uopt.在uopt.附近,曲线比较平坦,即u对H的影响不大.提示提高线速度可以节省分析时间.在低流速区操作(线速比uopt.小得比较多时),分子扩散的影响占主导.为了减小2Dm/u的值,必须减小Dm.应使用分子量较小的物质作流动相.在高流速区操作(线速比uopt.大得比较多时),传质阻力对H贡献占主要部分.为减小传质阻力,宜采用细颗粒固定相,分子量小的物质作流动相,选用具有较大的DS的固定相,且固定相用液量要小些.,78,第一章输入标题,二、液相色谱法速率理论,液体的扩散系数比气体小105倍,液体的黏度比气体大102倍,液体的表面张力比气体大104倍,液体的密度比气体大103倍,液体不可压缩,液体色谱的纵向扩散和传质阻抗影响大,79,第一章输入标题,二、液相色谱法速率理论,（一）Giddings液相色谱速率方程式,Giddings与Snyder等人提出的液相色谱速率方程式：,H=He+Hd+Hm+Hsm+Hs,H=A+B/u+Cmu+Csmu+Csu,Csmu为静态流动相传质阻力项,Dm为被分离组分的分子在流动相中的扩散系数,又因为液相色谱的Dm比气相色谱的Dm约小105倍，所以，纵向扩散项B/u可以忽略不计，则：,H=A+Cmu+Csmu+Csu,H=He+Hm+Hsm+Hs,80,第一章输入标题,He涡流扩散项Hm流动相传质阻抗项Hsm静态流动相传质阻抗项Hs固定相传质阻抗项,H=He+Hm+Hsm+Hs,涡流扩散致峰展宽是相同迁移速率分子走了不同路径所致；,动态流动相传质阻力致峰展宽是流路中心和流路边缘分子迁移速率不同所致；,静态流动相传质阻力致峰展宽是分子进入固定相较深孔穴内的静态流动相，晚回到流动相所致；,固定相传质阻力致峰展宽是分子进入厚涂层固定液，相对晚回流动相所致；,81,第一章输入标题,讨论：,1.流动相流速与板高的关系,H=A+Cu,uH,2.涡流扩散项,A=2dp,采用小粒度、球形固定相。常用310m的填料。匀浆法装柱。,3.传质阻抗系数,在液相中，采用化学键合相，“固定液”只是在载体表面的一层单分子层，因此，在固定相中的传质阻抗（Cs）可以忽略。则：,H=A+Cmu+Csmu,4.传质阻抗对板高的影响,减小d，增大D，则降低C及C以提高柱效。,Cm及Csm都与固定相的粒径平方dp2成正比，与扩散系数Dm成反比。因此，采用小粒度固定相及低粘度流动相。,高柱温可以增大Dm，但是，有机溶剂为流动相时，容易产生气泡，因此，一般采用室温。,82,第一章输入标题,（二）柱外效应,速率理论研究的是影响柱内溶质的色谱峰展宽及板高增加的因素，柱外如进样器流进色谱柱的管路，色谱柱到检测器的管路等均会引起色谱峰展宽。,色谱峰展宽的总方差等于柱内、柱外以及其他独立因素的方差和：,GC，色谱柱体积占色谱系统总体积的比例很大，柱外效应比较小；LC，色谱柱体积小，溶质在液相中的扩散系数很低，需要考虑柱外效应。,几个动力学方程的表达式,VanDeemter方程偶合式-Giddings方程吉丁斯认为,流动相传质对峰展宽的贡献比分子纵向扩散的贡献要大得多.由于存在径向扩散,分子集合在柱内的全部时间并不都在同一流路中运动,涡流扩散和流动相传质都是流动相分子对峰扩展的贡献,可以将它们合并为一个组合贡献:这时速率方程写成Giddings方程得到的偶合板高比VanDeemter方程低些,板高随线速度的关系趋缓,随着线速度增加板高增加减小.更接近实际,特别更适用于液相色谱操作.,Golay方程空心色谱柱不存在涡流扩散,但受色谱柱径向流速变化的影响,使分子集合的弥散增加.Golay等人研究得到,径向扩散对板高的贡献为(r0为柱管内径)板高方程为毛细管空心色谱柱的内径越小、固定相用量越少柱效越高。,3Horvath方程Horvath认为在液相色谱柱操作中，流动相与固定相之间存在的几乎静止的滞留层，分子穿越滞留层在两相间传质中起着主要作用，从而建立另一种动力学模型，称为间歇流滞留流体模型（InterstitalStagnantFluidmodel）。得到的方程专用于评价液相色谱中色谱峰的展宽。,Horvath方程中造成色谱峰弥散的几个因素(流动相、固定相)纵向扩散流动相中的涡流扩散流动相和固定相间的传质(吸附与解吸)动力学,影响色谱带展宽的其它因素,1非线性色谱分配等温线2活性中心的影响3柱外效应,1非线性色谱若分配平衡属非线性等温线,则形成不对称的拖尾峰或伸舌头峰.使峰宽度的增加.这种作用对峰基线宽度的影响比对半峰宽的影响要大。,2活性中心的影响是若固定相存在活性吸附中心,当样品量大时,载体表面强吸附活性中心被部分组分分子覆盖,不再承担分配平衡的任务;在小样品量时,载体表面活性中心不被覆盖,参与分配平衡,使被吸附的分子向