发酵过程最新版本

第一节发酵过程中的相关概念发酵机制的主题内容？研究发酵机制的目的？研究发酵机制的方法？,一、发酵过程中的代谢问题-代谢代谢(metabolism)是细胞内发生的各种化学反应的总称，它主要由分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)两个过程组成。,代谢（metabolism）：,细胞内发生的各种化学反应的总称,复杂分子（有机物）,分解代谢,合成代谢,简单小分子,ATP,H,发酵本身是一种代谢过程，(fermentation)是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。因此发酵过程总是和分解代谢偶联的。但在发酵条件下,有机化合物常常只是部分地被氧化，因此，在释放出一小部分能量的同时伴随大量发酵终端产物的生成。,二、发酵过程中的生物氧化问题-生物氧化生物氧化是一个逐步分解并释放能量的过程，是一个产能代谢过程。,在生物氧化过程中释放的能量可被微生物直接利用，也可通过能量转换储存在高能化合物(如ATP)中，以便逐步被利用，还有部分能量以热的形式被释放到环境中。不同类型微生物进行生物氧化所利用的物质是不同的，异养微生物利用有机物，自养微生物则利用无机物，通过生物氧化来进行产能代谢。,葡萄糖降解代谢途径生物氧化：发酵作用产能过程呼吸作用（有氧或无氧呼吸）,微生物的生物氧化与产能过程：脱氢（或电子）递氢（或电子）受氢（或电子）功能：产能（ATP）、还原力、小分子代谢产物等。,生物氧化的形式：某物质与氧结合、脱氢或脱电子三种,生物氧化的功能为：产能（ATP）、产还原力H和产小分子中间代谢物,自养微生物利用无机物异养微生物利用有机物,生物氧化,能量,微生物直接利用,储存在高能化合物（如ATP）中,以热的形式被释放到环境中,第二节微生物代谢（发酵）主要途径,一、EMP途径,+,丙酮酸,裂解,脱氢,异构,产能,脱水,异构,代谢途径,E2,E1,E3,过程中ATP的消耗和产生,21,葡萄糖6-磷酸葡萄糖,6-磷酸果糖1,6-二磷酸果糖,1,3-二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸,磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸,-1,-1,21,葡萄糖+2Pi+2ADP+2NAD+2丙酮酸+2ATP+2NADH+2H+2H2O,产生的能量,有氧时，2NADH进入线粒体经呼吸链氧化,原核生物又可产生6分子ATP,真核生物又可产生4分子的ATP再加上由底物水平的磷酸化形成的2个ATP，故共可产生原核2+6=8分子ATP；真核2+4=6分子ATP原核生物中,其电子传递链存在于质膜上,无需穿棱过程，而真核生物线粒体内膜是不能穿过NADH需要一个磷酸甘油穿棱系统。无氧时，2NADH还原丙酮酸，生成2分子乳酸或乙醇，故净产生2分子ATP,细胞对酵解速度的调控是为了满足细胞对能量及碳骨架的需求。在代谢途径中，催化不可逆反应的酶所处的部位是控制代谢反应的有力部位。糖酵解中有三步反应不可逆，分别由己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶催化，因此这三种酶对酵解速度起调节作用。,EMP的调控,二、HMP途径,1.概念：以6-磷酸葡萄糖开始，在6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下形成6-磷酸葡萄糖酸，进而代谢生成以磷酸戊糖为中间代谢物的过程，称为磷酸戊糖途径，简称PPP途径。又称磷酸已糖旁路,一、磷酸戊糖途径的概念,2.反应部位：胞浆,第一阶段：氧化反应生成NADPH和CO2第二阶段：非氧化反应一系列基团转移反应(生成3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖),二、磷酸戊糖途径的过程,磷酸戊糖途径二个阶段的反应式,磷酸戊糖途径总反应图,糖酵解途径,磷酸戊糖途径,第一阶段,第二阶段,C原子数目变化示意图,磷酸戊糖途径小结,反应部位：胞浆反应底物：6-磷酸葡萄糖重要反应产物：NADPH、5-磷酸核糖限速酶：6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD),磷酸戊糖途径的生物学意义,1、磷酸戊糖途径也是普遍存在的糖代谢的一种方式2、产生大量的NADPH，为细胞的各种合成反应提供还原力3、该途径的反应起始物为6-磷酸葡萄糖，不需要ATP参与起始反应，因此磷酸戊糖循环可在低ATP浓度下进行。4、此途径中产生的5-磷酸核酮糖是辅酶及核苷酸生物合成的必需原料。5、磷酸戊糖途径是机体内核糖产生的唯一场所。,磷酸戊糖途径的速度主要受生物合成时NADPH的需要所调节。NADPH反馈抑制6-P-葡萄糖脱氢酶的活性。,磷酸戊糖途径的调节,三、ED途径,ED途径(Entner-Doudoroffpathway)是1952年Entner和Doudoroff两人在研究嗜糖假单胞菌(Pseudomonassaccharvphila)时发现的。在ED途径中，6-磷酸葡萄糖首先脱氢产生6-磷酸葡萄糖酸，接着在脱水酶和醛缩酶的作用下，产生1分子3-磷酸甘油醛和1分子丙酮酸。然后3-磷酸甘油醛进人EMP途径转变成丙酮酸。1分子葡萄糖经ED途径最后生成2分子丙酮酸、1分子ATP、1分子NADPH和1分子NADH(图4-5)。所以，ED途径中2个丙酮酸的来历不同，这2个丙酮酸的羧基分别来自葡萄糖的第1位和第4位碳原子。,ED途径中的特征性酶是2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶，它催化2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(KDPG)裂解生成一个丙酮酸和一个3-磷酸甘油醛。ED途径可不依赖于EMP途径和HMP途径而单独存在，但对于靠底物水平磷酸化获得ATP的厌氧菌而言，ED途径不如EMP途径经济。但其特点是葡萄糖只经过4步反应即可快速获得EMP途径须经10步反应才能获得的丙酮酸。,四、WD途径,WD途径以发现者名字Warburg、Dickens、Horecker命名的。该途径的特征性酶是磷酸解酮酶，所以又称磷酸解酮酶途径(phosphoketolasepathway)。根据解酮酶的不同，把具有磷酸戊糖解酮酶的途径称为PK途径，把具有磷酸己糖解酮酶的途径叫HK途径。,PK途径是肠膜明串珠菌在进行异型乳酸发酵过程中分解己糖和戊糖的途径。首先将葡萄糖磷酸化，再将它氧化成6-磷酸葡萄糖酸，接着6-磷酸葡萄糖酸进一步氧化脱羧生成磷酸戊糖。PK途径关键性的反应是磷酸戊糖解酮酶催化的反应，使5-磷酸木酮糖裂解为乙酰磷酸和3-磷酸甘油醛，最终产物是乳酸、乙醇和CO2，并产生1分子的ATP。借助PK途径，微生物在厌氧条件下不仅可以利用葡萄糖，而且可以利用D-核糖、D-木糖和L-阿拉伯糖。,双歧杆菌分解葡萄糖的途径是HK途径，特征酶是磷酸己糖解酮酶。该酶催化的反应是6-磷酸果糖裂解为4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸。1分子葡萄糖经HK途径最终产生1分子乳酸、15分子乙酸和25分子的ATP。由于肠膜明串珠菌和两歧双歧杆菌细胞内分别不存在或仅具有微量的1，6-二磷酸果糖醛缩酶和6一磷酸葡萄糖脱氢酶，说明这两种细菌基本上不具有EMP、HMP和ED三条途径。,以上四种途径(EMP途径、HMP途径、ED途径和WD途径)都是葡萄糖先经磷酸化然后逐步被降解的。而有些微生物，如假单胞菌属、气杆菌属和醋杆菌属等某些菌没有己糖激酶，不能将葡萄糖磷酸化，但具有葡萄糖氧化酶，这样就采用葡萄糖直接氧化途径。,丙酮酸的代谢-常见初级发酵产物,乳酸、乙酸、乙醇、TCA中间体、甲酸等等,第三节主要初级发酵产物,一、乙醇发酵和甘油发酵1酵母菌发酵酵母菌属的一些菌种利用葡萄糖进行发酵，根据在不同条件下代谢产物的不同，可将酵母菌发酵分为以下三种类型。,(1)酵母菌的第一型发酵(乙醇发酵)酵母菌的乙醇发酵是一种研究最早、发酵机制最清楚的发酵类型。在厌氧条件下，酵母菌可将葡萄糖经EMP途径降解为2个丙酮酸，然后在乙醇发酵的关键酶-丙酮酸脱羧酶的催化下，丙酮酸脱羧生成乙醛，接着在醇脱氢酶的作用下，EMP途径中生成的NADH将乙醛还原成乙醇。每分子葡萄糖发酵生成2个乙醇和2个C02，并净得2个ATP，即,这是酵母的正常乙醇发酵，又称酵母的第一型发酵,(2)酵母菌的第二型发酵(甘油发酵)在进行乙醇发酵的酵母代谢时，若在培养基中加入亚硫酸氢钠，则发酵就会从乙醇发酵转向甘油发酵。这是因为亚硫酸氢钠可与乙醛发生加成反应生成难溶的磺化羟基乙醛，致使乙醛不能作为NADH2的受氢体，所以不能形成乙醇，而迫使用磷酸二羟丙酮代替乙醛作为受氢体，生成a-磷酸甘油。a-磷酸甘油进一步在a-磷酸甘油酯酶作用下水解脱磷酸而生成甘油，这称为酵母的第二型发酵。,由上述反应式可以看出，利用亚硫酸盐发酵生产甘油时，每分子葡萄糖只产生1分子甘油，不产生ATP，为了提供维持菌体生长所需要的能量，必须控制亚硫酸氢钠的加入量(亚适量水平)，以保证一部分的糖可进行乙醇发酵，否则酵母菌将因为得不到能量而停止生长。,(3)酵母菌的第三型发酵(甘油发酵)在弱碱性条件下(pH76)，酵母菌的乙醇发酵也会转向甘油发酵，这就是酵母菌的第三型发酵。此时，乙醛因得不到足够的氢而积累，2个乙醛分子间会发生歧化反应，1分子乙醛作为氧化剂被还原成乙醇，另一个则作为还原剂被氧化为乙酸。因此，第三型发酵除了有第二型发酵的甘油外，还有乙醇和乙酸。,2细菌的乙醇发酵不同的细菌进行乙醇发酵时，其发酵途径也各不相同。如运动发酵单胞菌(zymomonasmobilis)和厌氧发酵单胞菌(Zymomonasanaerobia)是利用ED途径分解葡萄糖为丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙醛，乙醛又被还原生成乙醇。由于发酵是经ED途径，所以每分子葡萄糖只能产生1分子ATP，产能是酵母乙醇发酵的一半，产生的乙醇仍是2分子。对于某些生长在极端酸性条件下的严格厌氧菌，如胃八叠球菌和兼性厌氧的肠杆菌则是利用EMP途径进行乙醇发酵。,二、乳酸发酵（结合实例）许多细菌能利用葡萄糖产生乳酸，这类细菌称为乳酸细菌。它们的营养要求较复杂，培养时一般要补充一些动植物的组织液或酵母浸出液。由于乳酸分子中含有一个不对称碳原子，因此发酵产物就有D-乳酸、L-乳酸和DL-乳酸。它们是由具有不同立体专一性的乳酸脱氢酶作用的结果。根据产物的不同，乳酸发酵有三种类型，即同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧发酵。,1同型乳酸发酵乳酸杆菌属、链球菌属的多数细菌都以这种方式产生乳酸。葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下被NADH还原为乳酸，由于终产物只有乳酸一种，故称为同型乳酸发酵。每分子葡萄糖生成2分子乳酸和2分子ATP，产生ATP的量与酵母的乙醇发酵相等，不产生C02。总反应式为,2异型乳酸发酵肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和葡聚糖明串珠菌(Leuconostocdextranicum)等通过PK途径进行异型乳酸发酵。发酵终产物除乳酸以外还有一部分乙醇，所以叫做异型乳酸发酵(参见图4-7)。葡萄糖经6-磷酸葡萄糖酸进一步氧化脱羧生成5-磷酸核酮糖，再经差向异构作用生成5-磷酸木酮糖。5-磷酸木酮糖经磷酸戊糖解酮酶催化，裂解为3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸，其中3-磷酸甘油醛进一步转化为乳酸，乙酰磷酸经两次还原变为乙醇。每分子葡萄糖产生乳酸、乙醇和CO2各1分子，并产生1分子的ATP，因此，这条途径产能只有同型乳酸发酵的一半。总反应式是,3双歧发酵双歧发酵是两歧双歧杆菌发酵葡萄糖产生乳酸的一条途径。此反应有两种磷酸酮糖酶参加，即6-磷酸果糖解酮酶和5-磷酸木酮糖解酮酶，分别催化6-磷酸果糖和5-磷酸木酮糖裂解产生乙酰磷酸和3-磷酸甘油醛及乙酰磷酸。每分子葡萄糖经双歧途径可以净得2.5分子ATP，因此它的产能水平高于同型乳酸发酵途径和异型乳酸发酵途径。,三、丙酸发酵许多厌氧菌可进行丙酸发酵，产物除丙酸外，还有乙酸和CO2。丙酸杆菌的丙酸发酵为琥珀酸-丙酸途径，其过程是：葡萄糖经EMP途径分解为两个丙酮酸，其中一分子丙酮酸氧化生成乙酸和CO2；另一分子丙酮酸经羧化生成草酰乙酸，再转化为琥珀酸，琥珀酸经甲基丙二酰CoA，最后经脱羧和转辅酶A反应生成丙酸(图4-11)。由图4-11可知，从丙酮酸生成丙酸是一个循环反应，其中关键性中间产物是甲基丙二酰CoA。,四、丁酸发酵与丙酮-丁醇发酵某些专性厌氧菌，如梭菌属、丁酸弧菌属、真杆菌属和梭杆菌属，能进行丁酸发酵与丙酮-丁醇发酵。丁酸发酵的代表菌是丁酸梭菌，发酵产物有丁酸、乙酸、C02和H2。梭菌利用PEP-磷酸转移酶系统吸收葡萄糖，葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸，接着在丙酮酸-铁氧还蛋白氧化-还原酶的参与下，将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。乙酰辅酶A再经一系列反应生成丁酸。在丁酸发酵过程中，每发酵1分子葡萄糖生成1分子的丁酸时，可产生3个ATP。总反应式为,在丁酸发酵中，丁酸不是由丁酰CoA直接水解生成，因为这样会浪费能量，而是由乙酰CoA与乙酸发生转CoA反应，生成丁酸和乙酰CoA，把能量储存在乙酰CoA中。,在丁酸发酵过程中，由于丁酸的生成，会导致环境的pH下降，当pH值降至45时，CoA转移酶被活化，这时有部分乙酰乙酰CoA转变成乙酰乙酸，再脱羧生成丙酮；另一部分乙酰乙酰CoA经还原生成丁酰CoA，然后进一步还原生成丁醇(图413)。在丙酮-丁醇发酵中，每2分子葡萄糖可生成1分子丙酮和1分子丁醇及4分子ATP，并放出4分子H2和5分子C02，即,五、混合酸发酵与丁二醇发酵某些肠细菌，如埃希氏菌属、沙门氏菌属和志贺氏菌属(Shigella)中的一些细菌，能够利用葡萄糖进行混合酸发酵。先通过：EMP途径将葡萄糖分解为丙酮酸，然后由不同的酶系将丙酮酸转化成不同的产物，如乳酸、乙酸、甲酸、乙醇、CO2和H2，还有一部分磷酸烯醇式丙酮酸用于生成琥珀酸；而肠杆菌、欧文氏菌属中的一些细菌，能将丙酮酸转变成乙酰乳酸，乙酰乳酸经一系列反应生成丁二醇与更多的气体。,在这两种类型发酵中，除琥珀酸是由磷酸烯醇式丙酮酸衍生而来以外，其余的发酵产物均来自丙酮酸。作用于丙酮酸的酶有三种，即丙酮酸甲酸裂解酶、乳酸脱氢酶和乙酰乳酸合成酶。丙酮酸甲酸裂解酶存在于兼性厌氧的肠细菌中，它催化丙酮酸分解生成乙酰CoA和甲酸。丙酮酸甲酸裂解酶是在厌氧条件下合成的，它在有氧时很容易失活，因此它只在发酵过程中起催化作用。即使在厌氧时，该酶的活性也不稳定，随丙酮酸浓度变化而变化，即丙酮酸浓度高则有酶活性，丙酮酸浓度低，酶活性丧失。无活性的丙酮酸甲酸裂解酶可被活化，但活化需要有还原型黄素蛋白、S-腺苷甲硫氨酸、活化酶和丙酮酸参与，其中丙酮酸在活化过程中起效应物的作用，本身并不被消耗。,乙酰乳酸合成酶是一种含硫胺素焦磷酸(TPP)的酶，它催化2分子丙酮酸反应生成a-乙酰乳酸。该酶在酸性条件下有活性，并且在pH6时活性最高，故有pH6酶之称。在这两条发酵途径中催化甲酸裂解生成CO2和H2的酶是甲酸氢裂解酶，它也是大肠杆菌和产气肠杆菌在厌氧条件下合成的一种酶。甲酸氢裂解酶实际上是一种复合物，它的活性需要有硒和钼两种元素作为活性因子，并且这两种元素也参与酶的组成。,丙酮酸在不同的机体内以及在不同酶作用下转变为不同的代谢产物和能量的过程总结于图中,第四节发酵与呼吸呼吸作用与发酵作用的根本区别在于：底物在氧化过程中放出的电子不是直接交给底物降解的中间产物(有机物)，而是通过一系列电子载体最终交给外源电子受体。,微生物通过氧化作用放出电子，并将释放出的电子经电子传递链(electrontransportchain)传给外源电子受体，从而生成水或其他还原型产物并释放出能量的过程，称呼吸作用(respiration)。根据外源电子受体的性质不同，可将呼吸分为有氧呼吸和无氧呼吸两种类型。其中，以分子氧作为最终电子受体的称为有氧呼吸(aerobicrespiration)，以氧化型化合物作为最终电子受体的称为无氧呼吸(anaerobicrespiration)。,一、有氧呼吸在有氧呼吸中，外源的电子受体是分子氧，而电子供体是微生物进行生物氧化的能源化合物(氧化底物)。,葡萄糖的有氧分解途径丙酮酸生成乙酰coA丙酮酸不能直接进入三羧酸循环，而是先要被氧化脱羧生成乙酰CoA，即,呼吸链电子传递系统(又称呼吸链)是由一系列氢和电子传递体组成的多酶氧化-还原体系，NADH、FADH2以及其他还原型载体上的氢原子以质子和电子的形式在其上进行定向传递；其组成酶系是定向有序的，按照氧化-还原电位升高的次序依次排列，但排列又是不对称的。电子传递链在原核微生物中存在于细胞质膜上，在真核微生物中存在于线粒体内膜上。大多数细菌呼吸链与真核微生物的不同，不同细菌的呼吸链也会有所不同，但是细菌和真核微生物的呼吸链相比有大致相似的组成成分，这些载体除醌及其衍生物以外，其余的都是一些带有辅基的蛋白质，电子传递通过这些辅基来完成。这些带有辅基的蛋白质的氧化-还原电位在NAD+和氧之间。电子传递系统中的氧化-还原酶主要包括NADH脱氢酶、黄素蛋白、铁硫蛋白、细胞色素、醌及其衍生物。,无氧呼吸某些厌氧和兼性厌氧微生物在无氧条件下进行无氧呼吸。无氧呼吸的最终电子受体不是氧，而是像NO3-、NO2-、SO42-、S2O32-、C02等一类外源受体(图4-19)。无氧呼吸也需要细胞色素等电子传递体，并在能量分级释放过程中伴随有磷酸化作用，也能产生能量用于生命活动。但由于部分能量随电子转移传给最终电子受体，电子传递链比有氧呼吸时短，所以生成的能量不如有氧呼吸产生得多。无氧呼吸是一类在无氧条件下进行的产能效率较低的呼吸作用。,第五节产品实例分析一、味精发酵机理-谷氨酸的发酵,合成谷氨酸的生化途径,谷氨酸生产菌的生化特征,1生物素缺陷型谷氨酸产生菌大多数为生物素缺陷型,谷氨酸发酵时,通过控制生物素亚适量(贫乏量),引起菌种代谢失调,使谷氨酸得到大量积累。2具有CO2固定反应的酶系菌种能利用CO2产生大量草酰乙酸,有利于谷氨酸的大量积累。,3.-KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失,这是菌体生成并积累-KGA的关键，从上图可以看出，-KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在-KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由-KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内-KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，-KGA才得以积累，为谷氨酸的生成奠定物质基础。,4.GA产生菌体内的NADPH氧化能力欠缺或丧失,（1）如上图所示，NADPH是-KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联的。（2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制-KGA的脱羧氧化有一定的意义。,5.产生菌体内乙醛酸循环（DCA）的关键酶异柠檬酸裂解酶,该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA循环的封闭是实现GA发酵的首要条件。糖的代谢才能沿着-酮戊二酸的方向进行,从而有利于谷氨酸的积累。,6.菌体有强烈的L-谷氨酸脱氢酶活性,-KGA+NH4+NADPH=GA+NADPL-谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内该酶的酶活性都很强，-酮戊二酸易生成谷氨酸。该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联，反应机制如下：偶联反应-KGANADPH-KGAGANADP异柠檬酸,L-谷氨酸脱氢酶,异柠檬酸脱羧氧化,GA生物合成的最理想途径,1.在前述GA合成所必需的条件的基础上（，封闭乙醛酸循环）体系不存在CO2固定反应，则有：3/2C6H12O6+NH4+C5H9NO4+4CO2产率：147/（180*3/2）=54.4%,2.在前述GA合成所必需的条件的基础上（，封闭乙醛酸循环）存在CO2固定反应，则有：C6H12O6+NH4+C5H9NO4+CO2产率：147/180=81.7%,可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。,CO2固定反应,(1)磷酸丙酮酸羧化酶的作用下磷酸丙酮酸+CO2+GTP=草酰乙酸+GDP(2)苹果酸酶的作用下丙酮酸+CO2+NADH=苹果酸+NAD需要Mn+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn+,提高GA的潜力,（1）强化CO2固定反应，具体措施：Mn+，生物素？（2）控制溶氧浓度是非常重要的低的溶氧浓度，则丙酮酸向乳酸方向转化高的溶氧浓度，则NADPH有被氧化的可能，,生物素对GA发酵的影响,GA产生菌大都是生物素的营养缺陷型，即：VH-生物素对发酵的影响是全面的，在发酵过程中要严格控制其浓度。,1.生物素对糖代谢的影响,VH对于糖酵解有促进作用;对丙酮酸的有氧氧化乙酰辅酶A的生成也有促进作用，但两者的促进作用不一样，对前者大一些这样培养基中如果有较丰富的VH，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致丙酮酸的积累，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，乳酸生成，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。,谷氨酸产生菌的发酵调控,二、乳制品发酵机理-乳酸发酵,同型乳酸发酵：通过EMP途径仅产生乳酸的发酵异型乳酸发酵：通过HMP和双歧途径（Bifidus途径）产生乳酸、乙醇、乙酸等有机化合物的发酵,异型乳酸发酵途径,2葡萄糖2ATP2ADP果糖-6-磷酸果糖-6-磷酸,ADPATP,转醛酶磷酸解酮酶转酮酶,赤藓糖-4-磷酸乙酰磷酸,木酮糖-5-磷酸,乙酸,异型乳酸(乙醇)发酵途径,5-磷酸-木酮糖磷酸(戊糖)解酮酶乙酰磷酸3-磷酸甘油醛ADPPi+2ADP2ATP乙酰CoA磷酸激酶NADH2ATP乙醛乙酸NADH2NADH2乙醇乳酸,双歧途径（Bifidus途径）,同型乳酸发酵与异型乳酸发酵的比较,三、柠檬酸发酵机理,关于柠檬酸发酵的机制有多种理论，目前大多数学者认为它与三羧酸循环有密切的关系。糖经糖酵解途径(EMP途径)，形成丙酮酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮酸脱羧形成C2化合物，两者缩合形成柠檬酸。,柠檬酸的溢出代谢：多种微生物均能因受刺激而过量合成柠檬酸。研究柠檬酸溢出代谢的最好的例子无疑是黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定环境条件下累积柠檬酸，是因为在这种环境条件下代谢途径前段的运转速率大于后段的运转速率。柠檬酸的溢出代谢是黑曲霉特有的遗传和生化机制与培养条件共同起作用的结果。引起溢出代谢的原因包括以下三个方面：,高水平的柠檬酸合成能力。这个能力由3个因素构成。第一:是在有高浓度草酰乙酸（OAA）的情况下对AcCoA具有高度亲和力的组成型的柠檬酸合成酶（CS）的存在；第二:是催化丙酮酸（PYR）固定CO2生成草酰乙酸反应的高水平的组成型的丙酮酸羧化酶（PC）的存在；,第三:是在缺少锰的条件下，蛋白质分解或蛋白质合成受阻造成的铵的高浓度能解除柠檬酸（CTA）对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。此外，柠檬酸的分泌，降低其胞内浓度。,较低的降解柠檬酸的能力。这能力由两个因素构成。第一是低水平的-酮戊二酸脱氢酶（KD）影响TCA环运行的畅通程度，使TCA环前半部的中间产物积压；第二，在锰缺乏的条件下，顺乌头酸酶（AE）和异柠檬酸脱氢酶（ID）的活性降低，从而使柠檬酸的累积比其它几种酸（顺乌头酸、异柠檬酸和-酮戊二酸）更明显。,在柠檬酸过量合成阶段，培养基的pH值显然会影响细胞膜对目的产物柠檬酸的跨膜输送；柠檬酸的分泌也会影响培养基的pH值。锰与铁的缺乏有利于柠檬酸的排出。,黑曲霉中柠檬酸的代谢溢出,TCA循环在柠檬酸积累中的调节,1)大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键；2)丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或极微弱;3)TCA循环的阻断或微弱(即顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶和酮戊二酸脱氢酶活力降低)，导致柠檬酸积累。而且，当柠檬酸浓度超过一定水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。,回补途径,TCA循环重要功能除产能外，为一些氨基酸和其它化合物的合成提供了中间产物；生物合成中所消耗的中间产物若得不到补充，循环就会中断；回补方式：通过某些化合物CO2固定作用，一些转氨基酶所催化的反应也能合成草酰乙酸和-酮戊二酸，通过乙醛酸循环,通过某些化合物的CO2固定作用使三羧酸循环的中间产物得到回补：丙酮酸羧化酶：CO2+丙酮酸+ATP+H2OMg+草酰乙酸+ADP+Pi磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶:CO2+PEP+H2O草酰乙酸+H3PO4苹果酸酶:CO2+丙酮酸+NADPH+H+苹果酸+NADP+,为了能够在己糖或戊糖的中间代谢物上进行好氧生长，异养微生物至少要具备上述几种酶之种的一个酶。,CO2固定作用补充TCA环的中间产物,转氨基作用,定义：-氨基酸的氨基通过酶的催化,转移到-酮酸的酮基上,生成相应的氨基酸;原来的-氨基酸则转变成相应的-酮酸。,R1CHNH2+COOH,R2C=OCOOH,R1C=O+COOH,R2CHNH2COOH,转氨酶,转氨基作用几点说明：,（1）可逆反应，（2）转氨酶的辅酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺（3）重要的转氨酶：丙氨酸转移酶（ALT）/谷丙转氨酶（GPT）天冬氨酸转移酶（AST）/谷草转氨酶(GOT)ALT常用于肝疾患（肝炎等）辅助诊断、AST用于心肌疾患（心肌梗塞等的辅助诊断）,CH3H-C-NH2+COOH,COOH（CH2）2C=OCOOH,丙氨酸-酮戊二酸丙酮酸谷氨酸,ALT：谷丙转氨酶，急性肝炎时血清ALT活性显著增高。,ALT,CH3C=O+COOH,COOH（CH2）2H-C-NH2COOH,COOHCH2+H-C-NH2COOH,COOH（CH2）2C=OCOOH,AST,天冬氨酸-酮戊二酸草酰乙酸谷氨酸,AST：谷草转氨酶，心肌梗塞时血清含量明显增高.,COOHCH2+C=OCOOH,COOH（CH2）2H-C-NH2COOH,乙醛酸循环,乙醛酸循环,能够利用乙酸的微生物具有乙酰CoA合成酶，它使乙酸转变为乙酰CoA；然后在异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶的作用下进入乙醛酸循环。乙醛酸循环的主要反应：异柠檬酸琥珀酸+乙醛酸乙醛酸+乙酸苹果酸琥珀酸+乙酸异柠檬酸净反应：2乙酸苹果酸,柠檬酸发酵机理,柠檬酸的发酵机理可概括为：大量的胞内NH4+和呼吸活性提高，使通过糖酵解途径的代谢得到加强葡萄糖经EMP通路分解成为丙酮酸，进入三羧酸循环，在丙酮酸脱氢酶复合物作用下氧化成为乙酰CoA及CO2，然后在柠檬酸合成酶作用下与草酰乙酸缩合而形成柠檬酸，而异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶因受到抑制，而使柠檬酸得以积累。,按照正常的微生物菌体的代谢规律，上述途径并不能够积累柠檬酸，而是进入TCA循环，被彻底氧化，柠檬酸产生菌之所以能够大量积累柠檬酸，其产生菌菌种必须具备一定的内在因素，也就是：柠檬酸后述的各种酶，主要是，顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶的活性丧失或非常微弱，否则，合成的柠檬酸迅速被降解成其他物质。,柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制追求柠檬酸的高产率,柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个中间性产物，在正常的微生物体内不能够积累的，如果有积累的话，与柠檬酸合成有关的各种酶的活性，则会受到抑制或阻遏，那么，柠檬酸发酵过程中，这种抑制或阻遏是如何被克服的呢？,1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节,？,在正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是从葡萄糖柠檬酸的合成过程中，PFK是一种调节酶或者称之为关键酶，其酶活性受到柠檬酸的强烈抑制，这种抑制必须解除，否则，柠檬酸合成的途径就会因为该酶活性的抑制而被阻断，停止柠檬酸的合成，研究表明，微生物体内的NH4+，可以解除柠檬酸对PFK的这种反馈抑制作用，在较高的NH4+的浓度下，细胞可以大量形成柠檬酸，那么NH4+浓度是如何升高的呢还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内铵离子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。,研究表明，柠檬酸产生菌黑曲霉如果生长在Mn+缺乏的培养基中，NH4+浓度异常的高，可达到25mmol/L，显然，由于Mn+的缺乏，使得微生物体内NH4+浓度升高，进而解除了柠檬酸对PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不断的合成大量的柠檬酸。,Mn+缺乏如何会使NH4+浓度升高呢？,当培养基中Mn+缺乏时，NH4+浓度升高，同时微生物体内积累几种氨基酸（GA谷氨酸、Arg、Gin谷氨酰胺等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高，微生物体内蛋白质和氨基酸的代谢关系可以使用下图示之：,2.顺乌头酸酶活性的控制,随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活(顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活)，更有利于柠檬酸的积累及排出该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量生成柠檬酸的必要条件。通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱，但在发酵过程中仍需要控制它的活性。由于该酶的活性受到Fe2+的影响，控制培养基中的Fe2+的浓度，可以使该酶失活。因此，柠檬酸发酵要求采用不锈钢反应器，目的就是控制培养基中的Fe2+的浓度。但是在柠檬酸发酵过程中，培养基中的Fe2+的浓度有要求不能够低于0.1mg/L，原因目前尚没有搞清楚。,顺乌头酸酶的活性：从理论上推测，顺乌头酸酶失活，三羧酸循环阻断是累积柠檬酸的必要条件。许多实验指出顺乌头酸酶活力变化与柠檬酸累积有密切关系。例如，产酸菌株的顺乌头酸酶活力比非产酸菌株低，产酸期比生长期低，生长在产酸培养基上菌株的顺乌头酸酶活比生长在非产酸培养基上的低。添加顺乌头酸酶抑制剂可促进柠檬酸积累。铁为顺乌头酸酶的激活剂，用亚铁氰化钾除铁，可以握高柠檬酸产率。,那么，解决了柠檬酸发酵过程中的上述几个问题：，是不是就意味着可以将葡萄糖源源不断的转化成柠檬酸呢？提问：根据微生物代谢调节的基本理论，还需要解决什么问题？,菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止，怎么能够大量合成柠檬酸呢？,3.能荷调节对柠檬酸发酵的影响,如果NADH（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍然不能够合成柠檬酸。,柠檬酸产生菌可在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有产生ATP。为了解释这种现象，有人提出了一种假设：该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。,解偶联剂（uncoupler）?,使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能进行，解偶联剂为离子载体或通道，能增大线粒体内膜对H+的通透性，消除H+梯度，因而无ATP生成，使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发。动物棕色脂肪组织和肌肉线粒体中有独特的解偶联蛋白(uncouplingproteins，UCPs)，与维持体温有关。常用解偶联剂主要有：质子载体：2，4-二硝基酚(DNP，图)，羰基-氰-对-三氟