酵母双杂实验步骤

2.1.1 酵母双杂交2.1.1.1 Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TTG-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TTG-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。通过PCR扩增获得带有attB位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65。获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：attB-PCR产物（10 ng/L）1-7LpDONR221 (150 ng/L)1LTE buffer, pH 8.0补足8L将上述混合物加入离心管中，加入2L BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25反应1h，加入1L蛋白酶K后，混匀离心，37反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50g/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。进行BP反应时，需注意以下几项：(1) 对于BP反应来说，最高效的是采用线性的attB-PCR产物和超螺旋的attP入门载体；(2) 为了提高BP反应的效率，可以将建议的25反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3) 提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10L体系中PCR产物最好不要超过250ng。2.1.1.2 诱饵载体构建重组的入门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下：入门载体 (50-150 ng)1-7LpDEST32 (150 ng/L)1LTE buffer, pH 8.0补足8L将上述混合物加入离心管中，加入2L LR反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25反应1h，加入1L蛋白酶K后，混匀离心，37反应10min终止BP反应，将LR反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDEST32载体为Gen抗性，所以选用含有50g/mL Gen抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度。LR反应注意事项：对于LR反应来说，最高效的是超螺旋的入门载体和目的载体进行反应，但对于超过10kb的载体，将载体线性化可能反而会提高反应的效率；为了提高LR反应效率，可以适当延长反应时间，这对于大于10kb的质粒非常有必要。2.1.1.3 转化酵母细胞转化前需小量制备MaV203酵母感受态细胞，步骤如下：(1) 将保存的MaV203菌株在YPAD平板上划线，30培养2天；(2) 挑取酵母菌单克隆至10mL YPAD液体培养基中，30，230rpm过夜培养；(3) 将过夜的酵母培养液在50mL的YPAD液体培养基中稀释至OD600为0.4左右，30，230rpm继续培养2-4h；(4) 室温下2500rpm离心5min收集菌体，弃上清，加入40mL 1TE（pH7.5）重悬；(5) 室温下2500rpm离心5min收集菌体，弃上清，加入2mL1LiAc/0.5TE重悬；(6) 室温静置孵育10min；(7) 立即用于下游的酵母小量转化实验。酵母感受态细胞制备完成后，按照表3-2中的组合进行转化，通过以下步骤将组合载体转入酵母细胞中：(1) 向每个1.5mL离心管中加入1g质粒、100g变性鲑鱼精DNA以及100L酵母感受态细胞；(2) 加入700L的1LiAc/40% PEG-3350/1TE并上下颠倒混匀，30孵育30min；(3) 加入88L的DMSO，混匀，然后42热击7min；(4) 在微量离心机中瞬时离心10s，弃去上清；(5) 加入1mL1TE重悬菌体后瞬时离心，弃上清；(6) 加入50-100L1TE重悬菌体，然后涂在SC-Leu-Trp平板上，30培养2天。表3-2 酵母转化组合Table3-2 Sets of plasmids used in yeast transformation assayLEU2 PlasmidTRP1 PlasmidPurpose1nonenoneNegative transformation control2pEXP32/Krev1pEXP22/RalGDS-wtStrong positive interaction control3pEXP32/Krev1pEXP22/RalGDS-m1Weak positive interaction control4pEXP32/Krev1pEXP22/RalGDS-m2Negative interaction control5pDEST32pDEST22Negative self-activation control6Bait plasmidpDEST22Test of self-activation2.1.1.4 自激活检测转化完成后，可以进行诱饵载体的自激活检测，同时确定文库筛选时的3AT浓度，具体步骤如下：(1) 从SC-Leu-Trp平板上挑取4个包含重组诱饵载体和pDEST22载体的单克隆，在一个新的SC-Leu-Trp分别划线，同时，分别挑取表3-2中组合1到5的2个单克隆作为对照，30培养18h；(2) 将SC-Leu-Trp作为样板影印至包含不同3AT浓度（0 mM, 10 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 和100 mM）的SC-Leu-Trp-His平板上，迅速进行影印清洁2-3次，30培养24h；(3) 24h后，再次进行影印清洁2-3次，然后继续放于30培养约2天（40-44h）后，进行观察，可以抑制包含重组诱饵载体和空猎物载体的酵母细胞生长的最低3AT浓度即为筛库时所用的3AT浓度，如果这个浓度为100mM，则表明诱饵载体本身存在自激活作用，筛库不能进行，若低于100mM，则筛库可以进行。2.1.1.5 文库筛选进行文库筛选之前，需将重组诱饵载体按照3.2.4.3中的转化方法转入MaV203中，在SC-Leu平板上筛选阳性克隆。然后进行文库筛选级别的酵母感受态细胞制备，制备过程如下：(1) 接种含有诱饵载体的酵母菌于20 mL SC-Leu培养基中，30过夜培养；(2) 翌日早上，将培养液加入300 mL SC-Leu液体培养基中至浓度为2106 cells/mL (OD600 =0.10)，30继续培养直至培养液浓度达到2107 cells/mL (OD600 =0.50)；(3) 室温1000-1500g离心5分钟收集菌体，30 mL无菌水重悬后转移至50 mL离心管中；(4) 1000-1500g 室温离心5分钟，弃上清，加入1.5 mL 1TE/1LiAc重悬；(5) 立即将感受态细胞用于转化。将文库转化入酵母感受态细胞的步骤如下：(1) 加1 g文库DNA和50 g高质量鲑鱼精DNA至每个1.5 mL离心管中，共加30个管，每个管里加入50 L重悬的酵母感受态细胞。注意：文库DNA和鲑鱼精DNA的总体积不能超过20 L，最好不超过10 L；(2) 加300 L除菌的40% PEG-3350/1LiAc/1TE 至每个离心管中，翻转离心管充分混合，30孵育30min；(3) 加DMSO到10% (40 L每管)，然后翻转混匀，42热击10min；(4) 从一个转化管中取出100 L转化液，用灭菌生理盐水按照1:100和1:1000进行稀释，每个稀释倍数涂100 L至10-cm的SC-Leu-Trp板子上；(5) 将30个管中的转化产物分别涂到30个15-cm含有合适的3AT的SC-Leu-Trp-His平板上，30培养3天；(6) 计算10-cm SC-Leu-Trp板子上的克隆数，最好平板上长有20到300个克隆，通过下面的公式计算转化效率：每个转化反应的克隆数=单个平板上的克隆数稀释倍数转化总体积/单个平板上涂的菌液体积；(7) 对每个SC-Leu-Trp-His+3AT平板进行影印清洁；(8) 30继续培养2-3天后，初步筛选出阳性的His+克隆。2.1.1.6 报告基因检测将SC-Leu-Trp-His+3AT平板上长出来的His+克隆子以及3.2.4.3中的转化组合2-6重培养的新鲜菌落，用无菌水稀释到同一浓度（一个直径1mm菌落加入30L无菌水中，用血球计数板将所有稀释液调整至同一浓度）。检测HIS3基因和URA3基因表达情况时，将每个菌落稀释液吸取3L点至SC-Leu-Trp-His+3AT，SC-Leu-Trp-Ura以及SC-Leu-Trp+5FOA（0.2%）平板上，30培养3-5天。检测lacZ基因表达情况时，吸取3L每个菌落的稀释液点至YPAD（覆盖NC膜）平板上，30培养2天，准备进行X-gal实验。X-gal实验的步骤如下：(1) 称取10mg X-gal溶解在100L DMF中，溶解后加入10mL的Z buffer中，同时加入60L -巯基乙醇，混匀备用；(2) 将两张直径125-mm的Whatman541滤纸叠放在直径15-cm的培养皿中，用约8mL的上述X-gal溶液完全浸润，并将气泡移除；(3) 用镊子将YPAD平板表面的带有菌落的NC膜轻轻取出，完全浸润在液氮中20-30s，然后将冻过的NC膜轻轻放在上述准备好的滤纸上面，移除气泡，然后轻轻将培养皿中多余的液体倒出；(4) 盖上培养皿的盖子，放置于37孵育，孵育时将培养皿倾斜一个很小的角度，从而避免X-gal在滤纸上过多的累