微生物的遗传变异和育种

化学治疗剂,能特异性地作用于某些微生物并具选择毒性的化学药剂。（对人体几乎无毒或很小，可用于微生物引起的疾病的治疗）合成药（主生长因子类似物）抗生素,抗代谢物,有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以致可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能，干扰代谢的正常进行。这些物质称为抗代谢物。,磺胺药(sulphonamides,sulfadrugs)抑菌机理,TMP:三甲基苄二氨嘧啶(磺胺增效剂),选择毒力,是由微生物在代谢过程中产生（有的可人工合成）可在低浓度下抑制或杀死其他微生物的有机化合物。,每种抗生素都有一定的杀菌范围，称为抗菌谱。（广谱，狭谱）,抗生素,抗生素的诞生,1928年A.Fleming发现青霉素,1940弗罗里提纯出青霉素,各种抗生素被相继发现并应用,人工合成半合成抗生素被相继开发出来,青霉素（penicillin）,英国科学家A.Fleming爵士,与弗莱明共同获得1945年诺贝尔生理学和医学奖.,1940提纯出青霉素,澳大利亚病理学家霍华德.弗罗里,人工合成半合成抗生素被相继开发出来,6-氨基青霉烷酸,神奇的抗生素,抑制细胞壁的形成,影响细胞膜的功能,干扰蛋白质合成,抑制核酸复制,和固醇结合影响细胞膜透性,作用于呼吸链影响能量利用,氨苄青霉素（ampicillin）,白点是强度各异的抗生素，最底下的青霉素完全没有黑环，显示它对链球菌已毫无作用,抗药性,改变细胞膜的透性而导致抗药性,细胞内被药物作用的部位发生了改变，目前典型的例子是核糖体发生了改变，抗生素核糖体结合蛋白质不能合成,救护途径,泵出机制,菌体内产生了钝化或分解药物的酶F,可怕的抗药性,第八章微生物的遗传变异和育种,微生物是遗传学研究的最好材料和对象,微生物结构简单,营养体一般都是单倍体,微生物繁殖速度快,存在多种方式的繁殖类型,环境条件对微生物作用直接均匀,易积累不同的中间及最终代谢产物,微生物的变异易被识别,参与基因工程的载体供体受体三角色,遗传的物质基础基因重组和杂交育种基因突变和诱变育种基因工程菌种的衰退复壮和保藏,内容提要,第一节遗传变异的物质基础,三个经典实验证明核酸是微生物遗传物质,细菌转化实验,噬菌体感染实验,植物病毒的重建实验,遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式,细菌转化实验(Avery),材料,方法,动物实验,细菌培养实验,S型菌无细胞抽提液试验,肺炎链球菌,有荚膜菌落光滑分泌毒素致病,无荚膜菌落粗糙无毒不致病,SSS三个血清型,RRR三个血清型,实验材料：肺炎链球菌,转化实验（1）动物实验,转化实验（2）细菌培养实验,转化实验（3）S型菌无细胞抽提液试验,只有S型细菌的DNA才能将S.pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的是遗传因子-DNA,噬菌体感染实验(Hershey和Chase),步骤,1：用含同位素35,P32的培养基培养大肠杆菌,结果：上清液中含15%放射性；沉淀中含85%放射性,2：让T2感染上述大肠杆菌使其打上S35P32标记,3：,含32P-DNA的一组,细胞培养产生大量完整子代噬菌体,植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒.,植物病毒的重建实验(Fraenkel-Conrat等),甲乙r感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒,乙甲r感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒,原始株拆开重建感染分离纯化,植物病毒的重建实验,基因是什么？,基因决定生物体的生、长、病、老、死等一切生命现象,基因是生命的密码,。基因记录和传递遗传信息,在生物体内具有自主复制能力的遗传功能单位。其物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的核酸片段。,基因是一段DNA,DNA就是脱氧核糖核酸（长链）,腺嘌呤（A）,鸟嘌呤（G）,胸腺嘧啶（T）,胞嘧啶（C）,A,T,C,G,A,A,A,T,T,T,T,T,T,A,A,A,G,G,G,G,G,C,C,C,C,C,G,C,基因测序就是读出A-C-G-T-G-G-A-C-G.,DNA,基因组和基因组学,基因组（genome）：泛指一个生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质（所有基因）。基因组学：(genomics)即发展和应用DNA制图、测序新技术和程序，分析生命体全部基因组结构及功能的科学；是研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。,大肠杆菌基因组,4100个基因，4.7106bp,遗传信息的连续性,功能相关的结构基因组成操纵子,结构基因单拷贝及rRNA多拷贝,基因的重复序列少而短,酵母菌基因组,染色体,长度Kb,基因数,1,2,3,4,5,6,7,8,染色体,长度Kb,基因数,439,745,666,1078,924,784,1092,948,230,423,173,814,292,136,573,291,231,387,334,550,487,421,571,499,13,10,27,13,10,33,11,10,24,16,22,21,15,20,17,4,遗传物质类型,核染色体,核外染色体,真核生物细胞器,原核生物质粒,遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式,原核生物基因调控系统,凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（generecombination）或遗传重组。作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。重组与杂交的关系,第二节微生物的基因重组,一、原核微生物通过接合、转化、转导、原生质体融合等形式进行一部分物质转移和基因重组。（小结）,二、真核微生物基因重组在有性繁殖过程中发生，当合子减数分裂时，两染色体发生交换。,接合及其发现,因子和接合,（一）接合(conjugation),雄性菌株与雌性菌株接合结果,通过供体菌和受体菌细胞间的直接接触经性菌毛进行大片段DNA的转移过程叫接合。接合子,接合及其发现（LederbergTatum）,因子与接合菌株,（性因子，致育因子）,F因子转移方式,几种杂交结果,接合的结果转性率高，染色体基因重组率低,Hfr菌株中F因子的整合、断裂和转移,Hfr的接合中断实验,接合的结果转性率低，染色体基因重组率高,雄性菌株与雌性菌株接合结果,（二）转化(transformation),几个概念：转化、转化因子、感受态,转化过程,转化的特点,转化(transformation),受体细胞直接吸收了来自供体细胞的DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。,转化因子,游离的DNA片断叫转化因子；,转化因子由供体提供；,自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生，实验室里通过提取获得；,主双链线性DNA有转化能力。,条件：高相对分子质量和同源性,受体细胞容易吸收外源DNA并实现转化的生理状态称为感受态。只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，从出现到消失约为40分钟(对数期的中期),感受态,感受态出现原因,细菌失去部分细胞壁的结果,细菌在细胞表面产生某种引起,感受态的决定因素,与感受态因子有关,和菌龄有关,环腺苷酸（cAMP）（可使Haemophilus提高10000倍）,Ca2+能促使细胞进入感受态,感受态因子,是受体细胞表面上的一种蛋白质,功能：使转化因子结合在受体细胞表面,转化过程,转化过程,每个受体细胞表面约有30-80个转化因子结合点，当转化因子结合到受体表面结合点上时，DNA一条链被受体细胞膜上的核酸酶分解，另一条链进入受体细胞，通过整合与受体细胞进行基因重组。有人发现DNA也可通过双链形式进入受体细胞形成双倍体的转化子。,转化过程,转化中基因交换过程示意图,转化的特点不需两个细胞直接接触，供体DNA提取出来，注入受体即可。(转化率：0.1-1%),（三）转导(transduction),转导（Transduction）:借助缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞中DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称转导。获得新遗传性状的受体细胞称为转导子（transductant）。完全缺陷噬菌体,部分缺陷噬菌体,转导的种类,转导的发现,转导(transduction),转导的特点,转导的发现：U型管实验（1952）,his-,trp-,鼠伤寒沙门氏菌,1946年J.Lederberg等采用E.coli的两株营养缺陷型进行实验,（1)普遍性转导（Generalizedtransduction）通过完全缺陷型噬菌体对供体菌任何DNA片段的“误包”，当它去感染受体菌时，使后者获得这部分遗传性状的现象称为普遍性转导（2）局限性转导（Restrictedtransduction）通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象。,转导的种类,完全缺陷噬菌体的产生,完全普遍性转导(compietetransduction),鼠伤寒沙门氏菌,A-B+组氨酸缺陷型,A+B-色氨酸缺陷型,完全普遍转导条件,供体菌野生型（鼠伤寒沙门氏菌）受体菌各种营养缺陷型完全缺陷噬菌体（P22，P1）（感染复数1）特点：供体任何基因都有可能进入受体细胞,流产转导的示意图,流产普遍转导,特征：形成微型菌落,局限性转导条件：供体菌溶源菌（野生型）大肠杆菌K12（）受体菌营养缺陷型（Bio-，gal-）部分缺陷噬菌体（d）（产生缺陷溶源菌）特点：只传递供体菌的少数特定基因,低频转导（LFT）裂解物的形成,低频转导（LFT）,发生误切频率104106因此形成转导子的频率低条件：感染复数m.o.i1供体菌为双重溶源菌E.coliK12(/dg)FUV,转导噬菌体（dg）50%+辅助噬菌体（）50%,再次侵染其他受体细胞，m.o.i1,侵染的50%受体菌变为转导子,转导的特点,需要噬菌体做媒介，不需要细胞间直接接触,噬菌体DNA不结合到宿主染色体上,噬菌体蛋白质包裹宿主任何一部分DNA片段,噬菌体DNA整合到宿主染色体上,噬菌体DNA与宿主染色体特定基因发生交换,普遍性转导,局限性转导,溶源转变,温和噬菌体的基因整合到宿主核基因组上的现象,温和噬菌体并不携带外源供体菌的基因,这种温和噬菌体是完整的，而不是缺陷的,获得新性状的是溶源化的宿主细胞，而不是转导子,获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失,三者根本区别在于DNA转移的方式不同,转化：供体DNA片断(通过细胞膜)注入受体细胞,接合：由供体(通过性纤毛)进入受体,转导：供体DNA片断(通过媒介噬菌体携带)进入受体。,（四）原生质体融合,通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，借以产生兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。融合子应用原生质体融合技术后，细胞间基因重组的频率大大提高了，在某些例子中，原生质体的重组频率已大于10-1。,主要步骤,选择亲株制备原生质体原生质体融合66原生质体再生筛选优良性状的融合子,离心、,（高渗下）,原生质体融合,聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合一般PEG的使用浓度范围在25-40%。原生质体只需要与PEG接触一分钟，紫外线照射或脉冲电场等物理因素处理也能促进原生质体融合。,原生质体融合的优点：,可以提高重组率可进行多亲本融合有利于不同种间、属间微生物的杂交通过原生质体融合提高产量,（五）染色体外遗传因子的转移与重组,细菌质粒转座因子,细菌质粒游离于细菌染色体外具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子（cccDNA）。赋予细菌特殊功能复制：严紧型、松弛型可消失，整合，脱离整合，重组,种类,用途:基因工程中作为目的基因载体,质粒,原核生物遗传物质存在的另一种方式,CoL产大肠杆菌素因子（编码免疫蛋白）,F因子与有性接合有关,R因子抗药性因子,Ti质粒诱癌质粒（200kb）,降解性质粒：编码降解有害物质的酶,巨大质粒（mega）,跳跃基因插入序列(IS)：分子量小，0.8-1.4kb转座子(转位子,易位子;Tn)：2-25kbMu噬菌体：37kb,E.coli的温和突变噬菌体，无一定整合位置，其转座可引起插入突变。,可移动遗传因子转座因子,二、真核微生物的基因重组,有性杂交准性杂交原生质体融合遗传转化,准性生殖是一种类似于有性生殖但比它更原始的生殖方式。准性生殖可发生在同一生物的两个不同来源的体细胞之间，经细胞融合但不发生减数分裂，导致低频率的基因重组。,准性生殖（parasexualhybridization,菌丝联结发生在一些形态上无区别，但遗传特性有差别的两个同种亲本的体细胞（单倍体）之间，发生的频率极低。异核体形成（质配）同一菌丝含有不同遗传性状的细胞核。具有野生型性状（基因互补功能），可在基本培养基上生长；异核体的分生孢子不能在基本培养基上生长。,基本过程：,核配形成杂合二倍体异核体中的二个核偶尔会发生核融合或核配(caryogamy)，形成杂合双倍体。它较异核体稳定，产生的孢子比单倍体菌丝产生的孢子大一倍。杂合二倍体产生的分生孢子能在基本培养基上生长。,体细胞交换和单倍体化杂合体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂的过程中，能发生体细胞染色体间的交换、分离（单倍体化）而产生具有新性状的单倍体杂合子、双倍体及非整倍体。,基因突变,突变与育种,第三节基因突变和诱变育种,突变的特点,一、基因突变,诱变机制和自发突变的原因,突变率,突变类型,突变类型,发生方式：,自发突变,诱发突变,突变表型：形态，生理生化，抗性，致病性等,遗传物质结构改变：,染色体畸变79,基因突变79,遗传物质结构改变,染色体畸变：缺失，重复，倒位，易位,条件致死突变型（株）,突变类型,突变株的表型,选择性突变株,非选择性突变株,营养缺陷型（株）,抗性突变型（株）,形态突变型（株）,抗原突变型（株）,产量突变型（株）,按突变株的表型是否能在选择性培养基上加以鉴别来区分,微生物突变体的主要类型,形态突变型,菌落形态突变型,菌体形态突变型,生化突变型,营养突变体(营养缺陷型),发酵突变体,抗性突变体,条件致死突变体,抗原突变型,产量突变型,按突变实质分,突变率,每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率；也可用每一单位群体在每一世代中产生突变株的数目来表示,突变的特点（证明）,不对应性,自发性,稀有性,独立性,诱变性,稳定性,可逆性,10-6-10-9,突变的性状和引起突变的原因间无直接的对应关系,可提高10-105,基因突变自发性和不对应性的证明,变量试验,涂布试验,影印培养试验,(在同一个大管中作整体培养),310314435,抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数,变量试验,涂布试验,影印培养试验,诱变机制,移码突变,染色体畸变,碱基的置换,碱基的置换,直接引起置换的诱变剂,间接引起置换的诱变剂,碱基的置换,T：烯醇式,5-BU:酮式,5-BU:烯醇式,碱基的置换,间接引起置换的诱变剂,碱基的置换,烯醇式,酮式,移码突变,DNA分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起,造成突变点以后全部遗传密码转录与转译发生错误,增添一个碱基,缺少一个碱基,染色体畸变,某些理化因子，如射线、紫外线、亚硝酸等，除能引起点突变外，还会引起DNA分子大损伤，包括染色体易位、倒位、缺失、重复等，即为染色体畸变。,染色体畸变,紫外线诱变作用机理,可使DNA链断裂，破坏核糖和磷酸间的键联，,引起胞嘧啶和尿嘧啶产生水合作用造成氢键断裂；,能使胸腺嘧啶形成二聚体，使DNA结构发生改变。,自发突变的原因,细胞内的代谢产物,环境因素的诱变,互变异构效应,DNA复制时的配对错误,二、突变与育种,效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1单位,从青霉素产量看诱变育种,诱变育种的基本环节,诱变育种工作中应考虑的几个原则,选择优良的出发菌株,选择简便有效的诱变剂,处理单孢子（或单细胞）悬液,选用最适剂量,设计或采用高效筛选方案或方法,利用复合处理的协同效应,利用和创造形态、生理与产量间的相关指标,选择简便有效的诱变剂,利用回变检测致癌剂艾姆斯试验法,挑选优良的出发菌株,采用具有有利性状的菌株,采用已发生其它变异的菌株,采用前体或最终产物代谢高的菌株,采用增变菌株,生产中用过的自发变异菌株,处理单孢子（或单细胞）悬液,芽孢杆菌应处理芽孢,放线菌，霉菌应处理孢子,细菌指数期；放线菌、霉菌要稍加萌发后使用,出发菌株应制成均匀悬液,选用最适剂量,剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示,合适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正变范围的剂量,充分利用复合处理的协同效应,两种或多种诱变剂先后使用,同种诱变剂重复使用,两种或多种诱变剂同时使用,利用和创造形态、生理与产量间的相关指标,淀粉酶变色圈试验,变色圈大的为淀粉酶高产菌落,设计或采用高效筛选方案或方法,第一轮,第二轮,五个出发菌株,突变株的筛选方法,高产突变菌株的筛选方法,抗性突变体的筛选方法,营养缺陷型的筛选方法,高产突变株的筛选,琼脂块培养法筛选春日霉素高产菌种,抗性突变体的筛选方法,青霉素浓缩法,梯度培养皿法,青霉素浓缩法,梯度培养皿法,含异烟肼,接敏感菌含突变株,异烟肼：吡哆醇结构类似物,与营养缺陷型的筛选相关的几个概念,相关培养基,基本培养基MM,完全培养基CM,补充培养基SM,三类遗传型,野生型A+B+,营养缺陷型A+B-A-B+,原养型A+B+,营养缺陷型的筛选办法,中间培养,淘汰野生型,检出缺陷型,夹层培养法,限量补充培养法,逐个检出法,影印接种法,鉴定缺陷型,菌丝过滤法,夹层培养法及结果,逐个检出法,影印接种法,限量补充培养基法,微量蛋白胨的基本培养基上小菌落是营养缺陷型突变株,菌丝过滤筛选营养缺陷突变株,基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。,第四节基因工程,1、衰退（degeneration）：在菌种培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。,第