SYBRGreenI荧光定量PCR.ppt

实时荧光定量PCR的应用,杨阳2.11-08-31,主要内容,第一部分：PCR简介第二部分：RNA的提取第三部分：RT第四部分：实时荧光定量PCR第五部分：数据分析第六部分：误差校正第七部分：常见问题分析,第一部分：PCR简介,PCR技术的发明,v1985年Kary.B.Mullis教授发明了具有划时代意义的PCR技术。,PCRPolymeraseChainReaction,vPCR(聚合酶链式反应)技术是一种体外快速扩增特定DNA片段的方法。v是一个在引物介导下反复进行热变性、退火、引物延伸三个步骤而扩增DNA的循环过程。v运用PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的DNA片段，使皮克(Pg，1012）起始物达到微克（g，106）水平。,2.PCR原理,PCR类型,RT-PCR兼并引物PCR巢式PCR反向PCR不对称PCR原位PCR,重组PCR荧光定量PCR锚定PCR多重PCR定量PCR,实时荧光定量PCR技术real-timefluorescentquantitativePCRFQ-PCR,是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR从定性到定量的飞跃。,实时荧光定量PCR技术分类,荧光探针Beacon法：以美国人Tagyi为代表TaqMan探针:以美国ABI公司为代表FRET技术:以罗氏公司为代表荧光染料饱和荧光染料:EvaGreen、LCGreen非饱和荧光染料:SYBRGreen,第二部分：RNA的提取,提RNA基本步骤,RNA的抽提注意事项,所有用具去RNase处理戴口罩、帽子，勤换手套，防外源RNase污染尽量快速4离心：室温会导致不适当分层，从而导致变异RNA产物。,一、标本的处理新鲜、低温保存、避免反复冻融。易至RNA降解，提取量下降。二、匀浆：Trizol裂解细胞，使核蛋白体解离，释放RNA；抑制RNase活性；酸性酚使RNA进入水相。过多：上清液变为红色，浪费。过少：未加氯仿前即分层。裂解不充分，RNase抑制不充分，得率低，RNA完整性、纯度受损。三、抽提、分层：氯仿变性蛋白，抽提去除过多的酚，加速有机相与水相的分层。过少：上述作用减弱，影响RNA质量。过多：使DNA和蛋白进入水相，影响RNA质量。四、沉淀：异丙醇过多：会沉淀盐和其他污染物，使用乙醇不能洗脱。五、洗涤：75%乙醇去盐作用，根据情况可重复几次。六、溶解：DEPC水掌握溶解时间。太早：沉淀物太湿，含有乙醇会影响后续反应。太迟：沉淀物太干，不易溶解。,RNA的抽提注意事项,4：过夜-70：一个月,4：过夜-20：时间长会使盐沉淀,4：1周-20：1年-70：1年以上,RNA得率检测分光光度计260nm:核酸280nm:蛋白等有机体230nm:杂质浓度320nm:溶液浑浊度总RNA浓度（ng/l）=OD26040稀释倍数（ng/l）OD260读数介于0.11.0之间可靠（203200ng/l）,RNA的质量,RNA的质量,RNA完整性鉴定,第三部分：RT,RT反应体系,RNA1gPrimer1L5ReactionBuffer4LRNaseinhibitor（20U/L）1L10mMdNTPmix2LReverseTranscriptase（200U/L)1LDEPC-treatedwaterupto20L,RT引物的选择,是一系列寡核苷酸片段的混合物，它含有各种可能的核苷酸排列顺序，因此可与任意核酸序列杂交。,RT反应条件,25,5min；(随机引物加此步)42,60min；70,5min。,RT反应的注意事项,冰上操作配制混合液试剂短暂离心移液枪：用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。,第四部分：实时荧光定量PCR,SY法-PCR反应基本组分,vDNAPolymeraseDNA聚合酶vdNTP四种脱氧核苷酸Buffer缓冲溶液rox内参染料SYBRGreen荧光染料vPrimerF/R引物（上游/下游）vTemplate模板,Mix,PCR实验操作注意事项,v冰上操作v配制混合液v试剂短暂离心v防止污染：分区操作v移液枪：用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。,PCR反应条件,95，10min；95，15sec，60，30sec，72，30sec，反应结束后，立即进行溶解曲线分析。95，15sec，60，60sec，95，15sec，60，15sec。,for40cycles,第五部分：数据分析,结果：扩增曲线熔解曲线,标本,阴性,阴性,标本,理论扩增曲线,实际扩增曲线,PCR扩增曲线,Rn（Normalizedreporter）：是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。Rn：Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（Rn=Rn-基线）。,Tm值：双链DNA解链50%的温度。,数据分析：,相对定量：不用得到绝对的拷贝数，只需计算表达差异即可，得到的结果是某基因表达水平升高了或降低了多少倍。2-CT表示实验组目的基因表达相对于对照组变化的倍数。Ct=Ct目的-Ct内参Ct=Ct实验组-Ct对照组,第六部分：误差校正,模板方面的误差：IPC校正取样量即细胞数量、抽提效率、纯化损失、反转录效率等操作误差：ROX校正试剂取用误差的主要部分、受耗材质量及仪器等影响而产生的荧光激发波动其余误差：统计校正重复实验，取平均值,总结,设计合格的引物。适当浓度的模板。设定内参和阴性对照。使用合适的ROX。实验时做复孔。冰上操作。,第七部分：常见问题分析,问题1：无Ct值出现,检测荧光信号的步骤有误:一般SG法采用72延伸时采集。引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。,问题2：Ct值出现过晚,扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。模板量低。,问题3：阴性对照有信号,Mix或水被污染。如使用ROX校正，则可能为ROX降解所致。引物二聚体的出现：35循环后出现属正常，配合熔解曲线进行分析提高退火温度；降低引物浓度；冰上操作；重新设计引物,问题4：溶解曲线不止一个主峰,引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。,cDNA为1：5引物终浓100nm,cDNA为1：5引物终浓50nm,问题5：重复性差,1.加样不准确。2.仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。3.模板浓度低。样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。,问题6：熔解曲线只有上升支,扩增产物的Tm值较高，设置熔解曲线时改95度为99度。,99.0,问题7：扩增曲线异常,基线设置有误。高浓度的模板会导致CT值过早出现，即基线范围变小，导致机器读取荧光数值有误。,问题8：扩增熔解曲线不同，ct值却相同,模板起始浓度相同，扩增效率不同。,问题9：ct值不同，熔解曲线同，扩增曲线还高,模板起始浓度不相同，扩增效率基本相同。,问题10：预实验时为单峰，正式时为杂峰。,cDNA为1：5引物终浓度50nm,cDNA为1：10引物终浓度50nm,cDNA为1：5引物终浓度100nm,cD