一份国自然标书模板及注解

申请代码 H0206 受理部门 收件日期 受理编号 解除保护 国家自然科学基金国家自然科学基金 申申 请请 书书 ( 2 0 1( 2 0 1 4 4 版版 ) ) 资助类别：面上项目 亚类说明： 附注说明： 项目名称：外源性多胺恢复老龄大鼠心肌缺血预适应保护作用的机制研究 申 请 人：王二 电话：依托单位：广州中医药大学 通讯地址：广州市机场路 16 号 邮政编码：510405 单位电话电子邮箱：science1343 申报日期： 2014年3月1日 国家自然科学基金委员会 注：该模板仅做格式参考。 第 2 页 版本 1.004.984 基本信息基本信息 yoKWT/OQ 申申 请 请 人 人 信 信 息 息 姓名 王二 性别 男 出生 年月 1984 年 12 月 民 族 汉族 学位 硕士 职称 副教授 每年工作时间（月） 10 电话电子邮箱 science1343 传真国别或地区 中国 个 人 通 讯 地 址 广州市机场路 16 号 工作单位 广州中医药大学 /第一附属医院 主 要 研 究 领 域 心肌干细胞 依托单位信息依托单位信息 名称 广州中医药大学 联系人 张坚 电子邮箱 zhangjian 电话网站地址 合作研究单位信息合作研究单位信息 单 位 名 称 中山大学 在此录入修改 项项 目 目 基 基 本 本 信 信 息 息 项目名称 外源性多胺恢复老龄大鼠心肌缺血预适应保护作用的机制研究 英文名称 aaa 资助类别 面上项目 亚 类 说 明 附注说明 申请代码 H0206:冠状动脉性心脏病 H2501:老年医学 基地类别 研究期限 2015 年 1 月 2017 年 12 月 申请经费 70.0000 万元 中中 文文 关关 键键 词词 冠心病;心肌梗死 英英 文文 关关 键键 词词 aa;bb 如果课题成员中有 来自其他单位，应 在此处纳入为合作 单位。合作单位不 能超过2个。 在关键词列表中选 入合适关键词 从第2页开始有版本 号，交正式纸质版 时切勿将不同版本 号的单页拼凑在一 起！ 如果既不是“博士”，也不是“高级职称”，则必须由2名研究领域相同、具有 高级职称的人员推荐（最好是正高），推荐信扫描作为附件附后。 第 3 页 版本 1.004.984 中中 文 文 摘 摘 要 要 ( (限限 400400 字字) )： ：缺血预适应（IPC）是缺血心肌保护的重要内源性机制，但老龄心肌对 IPC 刺 激减敏，具体机制不清。多胺具有广泛的生物学功能，最新研究发现其可通过诱导自噬发挥 抗衰老作用。已知老龄心肌多胺减少且自噬能力降低。前期我们已证实，缺血-再灌注（IR） 心肌多胺减少，外源性精胺具有保护作用；多胺是介导成年大鼠 IPC 心肌保护的信号分子。 据此，我们推测“外源性多胺可能通过诱导自噬恢复老龄心肌 IPC 保护作用” 。本课题首先 观察不同鼠龄大鼠 IPC 心肌的多胺代谢， 同时观察外源性多胺恢复老龄心肌 IPC 保护作用的 能力并探讨其机制。重点关注其对自噬、线粒体损伤及凋亡的影响。再给予调控自噬和 mPTP 开放干预，拟证明多胺发挥作用依赖的信号级联。进一步应用分离的老龄心肌细胞及线粒体 确定多胺作用的效应靶点。本课题首次在器官、细胞及分子水平上探讨多胺代谢、细胞自噬 在老龄心肌 IPC 保护中的作用及机制，为老龄心肌 IR 损伤的防治提供新思路 英英 文 文 摘 摘 要 要 ( (限限 3 300000 0 C Charactersharacters) )：aa 版本号，最终纸质 版与电子版的版本 号必须完全一致。 第 4 页 版本 1.004.984 项目组主要项目组主要参与者参与者（注: 项目组主要参与者不包括项目申请人） 编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮箱 项目分工 每年工 作时间 （月） 1 王一 1956-2-1 男 教授 博士 广州中医药大学3 science1343 研究设计 8 2 王三 1969-5-5 男 教授 博士 广州中医药大学3 science1343 心肌细胞培 养 6 3 王四 1992-1-1 女 医师 硕士 广州中医药大学3 science1343 线粒体功能 测定 9 4 王五 1966-6-6 男 高级统计 师 硕士 中山大学3 science1343 统计分析 9 5 王六 1995-1-1 女 硕士生 学士 广州中医药大学3 science1343 动物实验 10 6 在此录入修改 7 在此录入修改 8 在此录入修改 9 在此录入修改 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 6 4 1 1 说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请人负责填报（含申请人） ，总人数由各分项自动加和产生。 若出现其他单位， 请记得盖合作单位 公章（最后一 页）。比如合作单 位为“中山大学一附 院”，填“中山大 学”即可，盖中山大 学公章。 指每年从事本项目 的工作时间，一般 不超过10，也不宜 过少，申请者自己 把握。每年工作时 间过长不符合实 际，过短则质疑项 目能否如期完成。 第 5 页 版本 1.004.984 经费申请表经费申请表 （金额单位：万元） 科目 申请经费 备注（计算依据与说明） 一一. .研究经费研究经费 55.5000 1.科研业务费 8.5000 （1）测试/计算/分析费 2.5000 激光扫描共聚焦、Real time PCR 与流式细胞仪等 检测，图像处理与分析 （2）能源/动力费 1.5000 水电费 （3）会议费/差旅费 2.5000 参加国内学术会议 （4）出版物/文献/信息传播费 2.0000 文献检索、论文发表费 （5）其他 2.实验材料费 47.0000 （1）原材料/试剂/药品购置费 40.0000 购买试剂、试剂盒、抗体、合成 siRNA、购买引物 及所有实验用耗材 （2）其他 7.0000 购买实验动物及动物饲料费，购置高效液相色谱 柱，氧电极等消耗性仪器配件支出 3.仪器设备费 0.0000 （1）购置 0.0000 （2）试制 0.0000 4.实验室改装费 5.协作费 二二. .国际合作与交流费国际合作与交流费 7.5000 1.项目组成员出国合作交流 4.0000 到国外开会及去国外实验室交流学习支出 2.境外专家来华合作交流 3.5000 请国外专家来实验室交流 三三. .劳务费劳务费 3.5000 直接参加项目研究的研究生、博士后的劳务费用 四四. .管理费管理费 3.5000 不得超过申请经费的 5% 合合 计计 70.0000 与本项目相关的 其他经费来源 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配） 其他经费来源合计其他经费来源合计 0.0000 在填写经费申请 时，务必先阅读基 金委经费管理办法 我校管理费必为申 请总经费的5% 这句话不要改，其 他课题组成员是不 能提取劳务费的。 劳务费不超过15% 不超过15% 第 6 页 申请者在撰写报告正文时，请遵照以下要求： 1、 请先选定项目基本信息中的资助类别，再填写报告正文； 2、 在撰写过程中，不得删除系统已生成的撰写提纲（如误删可点击“查看报告正文撰写提纲”按 钮，通过复制/粘贴恢复） ； 3、 请将每部分内容填写在提纲下留出的空白区域处； 4、 对于正文中出现的各类图形、图表、公式、化学分子式等请先转换成 JPG格式图片，再粘贴到 申请书正文相应位置 5、 本要求将作为申请书正文撰写是否规范的评判依据，请遵照要求填写。 查看报告正文撰写提纲 报告正文报告正文 报告正文报告正文：参照以下提纲撰写，要求内容翔实、清晰，层次分明，标 题突出。 （一）立项依据与研究内容（一）立项依据与研究内容（4000-8000字 ）： 1项目的立项依据项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需 结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫 切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录） ； （1）老龄心肌缺血/再灌注（IR）损伤与缺血预适应（IPC）保护 人口老龄化是当今世界一个突出性的社会问题，我国人口老龄化发展速度尤其之快。提高老年 人的生活质量，已经成为全社会研究的重要课题。冠心病是引起老年人死亡的最常见原因，其基本 病理生理过程是心肌缺血，尽早恢复缺血心肌的血液供应能够挽救缺血心肌，但再灌注引起缺血/ 再灌注损伤 （ischemia/reperfusion injury, IRI） 。 缺血预适应 （ischemic preconditioning, IPC） 是心肌保护的新概念，是迄今为止最强的内源性心肌缺血保护方法。但由于老龄心肌细胞发生退行 性变，心肌细胞自噬能力降低，线粒体功能下降（mtDNA突变），氧化应激增强，老龄导致内源性保 护物质的生成减少以及IR损伤中发重要作用的蛋白质（膜受体、下游的激酶、磷酸酶、促炎细胞因 子等）表达/活性发生改变等，导致老龄心肌对缺血预适应刺激的敏感性减弱或消失【1,2】。因此， 迫切需要有效的措施改善或恢复老龄心肌对缺血预适应刺激的敏感性，提高老龄心肌抗缺血损伤的 能力，进而提高老年人的生存率。 （2）多胺代谢 带有多价正电荷的小分子多胺 （polyamine, PAs） 包括精胺 （spermine, SP） , 精 脒（spermidine, SPD）及腐胺（putrescine, PU），广泛存在于迄今人们所研究的所有真核细胞和原核细胞内，为细 胞的生长、分化和增殖所必需，并在许多病理过程中发挥重要作用【3】。目前，小分子多胺作为一 模板自带的提纲切 勿删除！一个字都 不要改，包括格 式。 从第6页开始不再显 示版本号，所以在 反复打印纸质版 时，只需重新打印 前5页和修改过的地 方，要低碳啊. 第 7 页 种内源性信号分子，已成为国际研究的热点【3-24】。 生物体内多胺水平受精确调控。鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase, ODC）和精脒/精胺 乙酰转移酶（spermidine/spermine N1-acetyltransferase, SSAT）分别为多胺合成与分解代谢的 限速酶。ODCODC催化鸟氨酸脱羧生成腐胺，腐胺连接到S-腺苷甲硫氨酸上，在S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶 （S-adenosylmethionine decarboxylase, SAMDC）的催化下脱羧生成精脒，精脒通过精胺合成酶催 化产生精胺。ODCODC可被多种生长因子、原癌基因、肿瘤促进剂和应激刺激等激活【4,5】；SSATSSAT催化 多胺的逆转化分解代谢，依次催化精胺转化为精脒，精脒转化为精胺。此分解反应过程中产生两种 有毒代谢副产物3-氨基丙醛和过氧化氢（H2O2），因此，SSAT过度激活（多胺分解代谢增强）引起 组织细胞损伤【6】。 （3）多胺的生物学作用 多胺具有广泛的生物学功能，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡、调控线粒体通透转运（MPT）、调控 离子通道、促细胞增殖及在细胞内信号转导中发挥重要作用等【7-15】。文献报道，连续3天给小鼠 腹腔注射精胺(10 mg/kg) 能明显抑制内毒素诱导的血清中炎症介质的释放【7】；多胺可抑制幅射 等所引起的DNA损伤和脂质过氧化。活性氧可导致DNA断裂和/或硷基修饰，发生程序性细胞死亡，天 然多胺含有类似叠氮钠(单线态氧淬灭剂)的氨基而发挥保护作用【8】；多胺可通过与细胞内带负电 荷的生物大分子如核酸及蛋白质等结合稳定染色质、 核酶、 核酸和/或细胞膜。 在分离的肝脏线粒体， 精胺通过清除羟自由基， 维持谷胱苷肽和巯基的还原状态， 抑制线粒体通透转运孔 （mPTP()开放 【9】 。 在小鼠WEH1231B细胞和人的T细胞，多胺合成抑制剂引起线粒体膜电位（m）下降和caspase-3 激活，外源性多胺可逆转之【10】；细胞内精胺负责内向整流钾通道（irK1）的固有门控和整流特 性，精胺通过调控谷氨酸盐受体的某些亚型，影响神经系统神经元和神经胶质细胞的兴奋性和Ca2 的内流【11】；多胺可直接激活TPK和MAPK，促进原癌基因c-myc, c-jun和c-fos的表达【12】。 RTK，PI3K和PKC抑制剂均能抑制生长因子诱导的ODC的磷酸化【13】。多胺为生长过程所必需，但过 度产生也常伴有致癌和致组织细胞损伤作用【14,15】。 随年龄增加哺乳类动物组织器官多胺水平降低（肝、肾、骨骼肌、心脏、肺等）,多胺合成限速 酶ODC也呈相同下降趋势【16】。在老龄的组织细胞，激素诱导ODC激活的能力也明显降低【17】； 健康人血清及尿液中多胺水平也随年龄增加而降低【18】。目前已知，多种食物中富含多胺包括蔬 菜、水果、鱼、肉、蛋、奶以及发酵食物如奶酪等，摄食富含多胺的食物对老年人的健康有益【19】。 动物实验也证明，小鼠长期摄食富含多胺的食物，能明显降低老化相关的疾病，如肾小球硬化、动 脉硬化，降低死亡率【20,21】。最新研究显示（2009, 2010年文献），多胺可通过诱导细胞自噬延 长生物体的寿命，具有抗衰老作用【22-24】。Morselli的研究显示，精脒能够诱导培养的酵母、线 第 8 页 虫、果蝇、小鼠细胞及人的肿瘤细胞自噬，敲除或沉默重要的自噬相关基因（如atg-7，bec-1）取 消了精脒延长寿命的作用；小鼠的饮水中加入多胺，也能显著减少衰老引起的氧化应激和细胞坏死 【23】。Eisenberg证明精脒延长寿命的机制是通过抑制组蛋白乙酰转移酶使组蛋白去乙酰化，进而 转录激活自噬相关基因atg7, atg11和atg15,诱导细胞自噬【24】。 （4）衰老心肌自噬能力下降及其影响的下游事件 自噬是存在于真核细胞中的生命现象，通过自噬清出细胞内受损的蛋白质和细胞器，维持细胞 内稳态，对生物体正常发育及防治老化有积极的作用。分子水平上的研究发现，调节自噬和调节衰 老的信号通路之间存在相互联系【25】。研究显示，随着年龄增加心肌细胞自噬能力明显降低，导 致变性的蛋白质和损伤的细胞器不能有效被清除,细胞稳态发生变化【26】。衰老心肌线粒体自噬减 少导致线粒体功能异常，表现为线粒体数目减少，体积增大，呼吸链上的各种酶复合体活性下降， 呼吸链电子传递功能障碍，能量代谢障碍。线粒体功能异常导致呼吸链电子漏出ROS产生增加、线粒 体DNA发生突变、蛋白质交联、巯基氧化、DNA甲基化下降、组蛋白乙酰化失控和生物膜脂质过氧化， 造成大量的变性蛋白质和受损细胞器堆积在细胞内【27】。线粒体损伤使线粒体膜电位降低，线粒 体发生通透性转运，cytc及凋亡诱导因子（AIF）释放入胞浆，引起细胞凋亡。近年来研究发现，自 噬可通过清除受损的线粒体延迟和对抗凋亡【28】。在营养缺乏的情况下，少量线粒体通透转运孔 （mPTP）开放，启动细胞自噬清除受损的线粒体，对细胞有保护作用。损伤严重时，大量的线粒体 mPTP开放，cytc和AIP等释放入胞浆，激活凋亡程序。Xue等学者应用自噬抑制剂或基因沉默等手段 证明自噬的发生早于凋亡【29】。Yan在猪慢性心肌缺血的实验中证实，自噬能够抑制慢性缺血引起 的细胞凋亡，减轻缺血性心肌损伤【30】。Tracy的研究也显示线粒体损伤和mPTP开放是低氧诱导自 噬的关键因子，能够促进营养缺乏状态下自噬体的形成,有利于细胞存活【31】。因此提示：衰老的因此提示：衰老的 心肌细胞自噬能力下降老化和受损的线粒体堆积氧自由基产生增加心肌细胞自噬能力下降老化和受损的线粒体堆积氧自由基产生增加mPTPmPTP开放数目开放数目增加细增加细 胞凋亡。这可能是老龄心肌丧失缺血预适应保护作用的重要机制。小分子多胺在这一级联反应中发胞凋亡。这可能是老龄心肌丧失缺血预适应保护作用的重要机制。小分子多胺在这一级联反应中发 挥怎样的作用挥怎样的作用? ? 还不清楚？还不清楚？ (5)国内外研究现状及我们的工作基础 从文献检索看，关于多胺的研究，国内外差距较大。表现在国内发表的论文数量少,主要涉及肿 瘤诊断及癫痫、 胃炎等多胺含量测定 【32-34】 ， 个别涉及细胞凋亡相关基因克隆、 多胺代谢等 【35】 。 多胺与心血管系统的关系少见报道（仅见于我们自己发表的文章，见作者代表作）。国外的大部分 研究主要集中在多胺与肿瘤和脑损伤的关系，小部分涉及肠、肝、肺、肾等器官36。多胺在心肌 的作用主要集中在多胺与心肌肥大的关系涉及心肌缺血的较少。Woodcock 等报道到，大鼠心肌缺血 /再灌注引起IP3释放伴再灌注性心律失常发生，庆大霉素和精胺(5mM)有效抑制之【37】。Ventura 在标书的正文部 分，申请者可以根 据需要对关键文字 或段落通过加粗或 改变颜色的方式， 加以强调，引起评 审专家注意。 第 9 页 等的研究发现，精胺可诱导电刺激大鼠心脏发生负性肌力作用伴Ca2+i短暂降低，无刺激则不改变 静息状态下的Ca2+i【38】。我们自己最的系列研究显示，多胺在成年大鼠心肌IR损伤及IPC保护 中发挥重要作用【39,40】。但关于多胺在老龄缺血心肌的作用，国内外均未见报道。因此，多胺在 老龄心血管系统中的生理作用和病理意义有待研究。 前期我们在国家自然科学基金课题的资助下（NO.30770878，2007-2010，本人为课题主持人） 在离体灌流成年大鼠心脏上首次发现，IPC处理能够上调成年大鼠心肌的多胺合成代谢（多胺合成限 速酶ODC表达增加，总多胺池增加），给予ODC特异性抑制剂-difluoromethylornithine(DFMO) 取 消了IPC介导的心肌保护作用，证明多胺是介导IPC心肌保护作用的内源性信号分子（见后面工作基 础）；进一步证明IPC诱导的ODC/多胺通路上调主要与PKC、Erk1/2、PI3K/Akt信号转导通路的激活 有关【39】。文章发表在Mol Cell Biochem. 2009 (332) 135Mol Cell Biochem. 2009 (332) 135144144上。之前我们的另一项国家自然 科学基金资助课题 (NO.30470688，20052007, 本课题申请人为第二完成人）的研究发现,缺血/ 再灌注(IR)损伤心肌多胺代谢失衡， 腐胺增加， 精脒、 精胺减少总多胺池耗竭。 外源性精胺 (1mmol/L) 能补充细胞内的多胺池，并通过下调死亡受体通路、抑制线粒体凋亡通路、清除自由基、抑制细胞 内钙超载发挥心肌保护作用【40】。文章发表在European Journal of European Journal of Pharmacology 2007,Pharmacology 2007,（562562） 236236246.246.上（见后面工作基础）。 （6）本课题关注的问题 基于我们前期的研究发现及文献报道心肌组织中的多胺随年龄增加而减少，多胺具有诱导细胞 自噬、抗炎、抗氧化清除自由基、抗凋亡、调节线粒体钙缓冲以及多胺在细胞内信号转导中发挥重 要作用等独特的生物学功能。我们提出：“外源性多胺可能恢复老龄心肌对IPC刺激的敏感性”。预 实验结果初步证实了我们的推测。我们在离体心脏灌流模型上观察到，老龄大鼠心脏在离体灌流前 慢性给予外源性多胺（多胺灌胃6周，参照文献给药量【20】），多胺恢复了老龄心肌对IPC刺激的 敏感性（心脏功能有明显改善，冠脉流出液中LDH水平有明显降低），多胺合成限速酶ODC特异性抑 制剂DFMO取消了这种改变（实验数据见后面的研究工作基础）。但关于老龄IR与IPC心肌多胺代谢的 特点和规律如何？外源性多胺能否恢复老龄心肌对IPC刺激的敏感性？如果能， 其机制是什么？以及 多胺在老龄IPC心肌保护中作用的准确效应靶点是什么？这些还不清楚， 这些是本课题研究的主要内 容。 本课题将在原有工作基础上，在器官、细胞及分子水平上观察青年与老年本课题将在原有工作基础上，在器官、细胞及分子水平上观察青年与老年 IRIR 与与 IPCIPC 心肌多胺代心肌多胺代 谢变化的规律和特点，探讨老龄心肌谢变化的规律和特点，探讨老龄心肌 IRIR 损伤及损伤及 IPCIPC 保护和多胺水平变化的内在联系。观察外源性多保护和多胺水平变化的内在联系。观察外源性多 胺对老龄胺对老龄 IPCIPC 心肌心肌细胞自噬、 线粒体功能、 氧化应激及细胞凋亡的影响。 通过诱导或阻断自噬 （细胞自噬、 线粒体功能、 氧化应激及细胞凋亡的影响。 通过诱导或阻断自噬 （siRNAsiRNA 干扰）和调控线粒体通透转运（开放或抑制干扰）和调控线粒体通透转运（开放或抑制 mPTPmPTP）干预，探讨外源性多胺是否通过诱导自噬）干预，探讨外源性多胺是否通过诱导自噬/ /减少减少 第 10 页 线粒体损伤线粒体损伤/ /抑制氧化应激抑制氧化应激/ /抗凋亡级联重现老龄心肌抗凋亡级联重现老龄心肌 IPCIPC 保护作用。并进一步细胞、亚细胞水平上保护作用。并进一步细胞、亚细胞水平上 探讨多胺发挥作用的准确效应靶点。以上问题的解决将能够验证我们提出的探讨多胺发挥作用的准确效应靶点。以上问题的解决将能够验证我们提出的“多胺是介导缺血预适多胺是介导缺血预适 应心肌保护的内源性信号分子、多胺代谢通路可能成为老年心肌缺血应心肌保护的内源性信号分子、多胺代谢通路可能成为老年心肌缺血/ /再灌注损伤防治的新靶点再灌注损伤防治的新靶点”的的 假说。目前，国内外未见相关报道假说。目前，国内外未见相关报道。本课题的完成，为老龄心肌缺血/再灌注损伤的防治提供一种新 思路、新靶点和新的技术平台。具有重要的理论意义和应用价值。 参考文献： 1. Boengler K, Schulz R, Heusch G. Loss of cardioprotection with ageing. Cardiovasc Res. 2009;83(2):247-261. 2. Jahangir A, Sagar S, Terzic A. Aging and cardioprotection. Appl Physiol. 2007;103(6):2120-2128. 3. Wang YL, Jr. Casero R. Mammalian polyamine catabolism: Atherapeutic target, a pathological problem, or both? J. Biochem. 2006;(139):17-15. 4. Voskas D, Mader R, Lee J. Tumour promoter mediated altered expression and regulation of ornithine decarboxylase and S-adenosylmethionine decarboxylase in H-ras-transformed fibrosarcoma cell lines. Biochem Cell Biol. 2001; 79:69-81 5. Turchanowa L, Rogozkin VA, Milovic V, Feldkoren BI, Caspary WF, Stein J Influence of physical exercise on polyamine synthesis in the rat skeletal muscle. Eur J Clin Invest. 2000;30:1-3. 6. Zahedi K, Lentsch AB, Okaya T, et al. Spermidine/spermine-N1-acetyltransferase ablation protects against liver and kidney ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2009; (4):G899-909. 7. Zhu S, Ashok M, Li J, Li W, Yang H, Wang P, Tracey KJ, Sama AE, Wang H. Spermine protects mice against lethal sepsis partly by attenuating surrogate inflammatory markers. Mol Med. 2009;(7-8):275-282. 8. Das KC, Misra HP, Hydroxyl radical scavenging and singlet oxygen quenching properties of polyamines, Molec Cell Biochem. 2004;(262):127-133 2项目的研究内容、研究目标项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题以及拟解决的关键科学问题（此部分为 重点阐述内容） ； 2.12.1研究内容研究内容 （1）在器官水平上观察青年与老年大鼠IRIR、IPCIPC心肌多胺代谢变化的特点与规律。应用离体灌 流大鼠心脏，复制青年与老年大鼠心肌缺血/再灌注（IR）与缺血预适应（IPC）模型，观察心肌多 胺代谢情况（多胺合成与分解限速酶与多胺池的变化）。观察指标： 多胺代谢分析：高效液相色谱法测定心肌组织中多胺，包括腐胺、精脒、精胺的含量；14C-标 参考文献请按照规 范的格式，务必准 确，如文献较多， 应引用经典的、核 心的、最近的文 献。 我们需要把有限的时间留 给认真准备标书的老师。如标书正文存 在明显的敷衍、应付，研究内容完全不符合国家自然科学基金的 资助内容，后果自负。 第 11 页 记，液闪计数法分析多胺合成限速酶鸟氨酸脱羧酶（ODC）与分解代谢限速酶精脒/精胺乙酰转移酶 （SSAT）活性；免疫印迹法分析多胺合成与分解代谢限速酶ODC和SSAT蛋白表达。 （2）在器官水平上观察外源性多胺能否通过恢复细胞内多胺池重现老龄心肌IPCIPC保护作用。老 龄大鼠多胺灌胃给药6周，取心脏复制离体灌流心脏IPC模型，与未给药的老龄IPC心脏比较，观察外 源性多胺对老龄大鼠心肌多胺池的影响， 同时观察外源性多胺对老龄大鼠心肌IPC刺激敏感性降低或 丧失的恢复能力（心脏功能与心肌损伤评价）。再给予多胺处理的IPC心脏多胺合成限速酶ODC的特 异性抑制剂DFMO观察其对IPC心肌保护的干预作用。观察指标: 多胺代谢分析：（同上）。心功能评 价:多导生理记录仪记录心功能变化（LVDP、LVEDP、dp/dt、心率、冠脉流量等）。心肌损伤评价： TTC染色法测定心肌死面积观察；比色法检测冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）含量变化；透 射电镜观察心肌细胞超微结构观察 （3）在器官上观察外源性多胺对老龄IPC心肌细胞自噬、线粒体功能、氧化应激及细胞凋亡的 影响，给予多胺抑制剂、自噬抑制剂以及mPTP开放剂干预，探讨外源性多胺的作用机制。老龄大鼠 多胺灌胃给药6周后，取心脏复制离体灌流心脏IPC模型，与未给药的老龄IPC心脏比较,观察心肌细 胞自噬、线粒体功能、细胞氧化应激及细胞凋亡情况。再分别给予多胺处理的IPC心脏多胺合成限速 酶ODC的特异性抑制剂 （ -difluoromethylornithine， DFMO） 、 细胞自噬抑制剂(3-methyladenine， 3-MA）及mPTP开放剂 (atractyloside, Atr) 干预，观察药物干预是否取消了外源性多胺在IPC心脏 的作用。观察指标：细胞自噬分析：透射电子显微镜观察双层膜的自噬体；Real-time PCR 方 法检测自噬相关基因atg-5,Beclin-1表达；免疫印迹法检测自噬体膜标志性蛋白质LC3，Beclin-1 表达。线粒体功能评价：线粒体呼吸酶复合体，, ，的活性变化；线粒体呼吸控制率 变化（RCR）；高效液相色谱分析心肌ATP, ADP, AMP水平，观察心肌能量代谢情况。细胞氧化应 激水平分析: 细胞脂质过氧化水平， 丙二醛 （MDA） ； 抗氧化酶的变化： 超氧化物歧化酶 （MnSOD） , 谷胱甘肽过氧化物酶（CAT）活性测定； 线粒体氧化损伤的评价：测定线粒体DNA(mtDNA)氧化产 物（8-OHdG）生成量和mtDNA编码的呼吸酶复合I成分ND6的表达（免疫印迹法）。细胞凋亡观察： 细胞凋亡检测(TUNEL法)；促凋亡蛋白Cyt c, Bax, Caspase-9和抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xL表达水 平（免疫印迹方法检测）。 （4）在衰老的心肌细胞模拟IPC模型上观察外源性多胺对心肌细胞自噬、线粒体功能、细胞氧 化应激及细胞凋亡的影响。给予多胺抑制剂、自噬抑制剂及mPTP开放剂干预，观察外源性多胺对IPC 心肌的影响。在细胞水平上观察外源性多胺能否恢复老龄心肌细胞IPC保护作用并探讨其机制。应用 D-半乳糖诱导分离培养的乳鼠心肌细胞衰老。应用模拟缺血/缺氧液复制IR与IPC心肌细胞模型。给 予外源性多胺处理的IPC心肌细胞后， 再予多胺合成抑制剂 （DFMO） 、 细胞自噬抑制剂 （3-MA） 及mPTP 研究内容要集中，与研究目标紧密一致，只做支撑课题最关键、最必要的内容。不可为 多做实验显示劳动量或为了增加预算而使研究内容过多过泛。 第 12 页 开放剂（Atr）干预，观察外源性多胺对衰老的IPC心肌细胞自噬、线粒体功能、氧化损伤以及细胞 凋亡影响。观察指标：心肌细胞自噬分析：透射电子显微镜观察双层膜的自噬体；荧光显微镜 下观察自噬体膜标志蛋白（LC3-GFP）转染细胞后，LC3荧光变化； 荧光显微镜下观察丹(磺)酰戊 二胺(MDC)荧光染色情况；免疫印迹方法检测自噬相关蛋白Beclin1, LC3 的表达。线粒体功能评 价:（同上）。心肌细胞氧化损伤：MTT方法检测细胞存活率；H2-DCFDA标记心肌细胞，流式细 胞仪检测ROS生成率；DHE荧光探针标记细胞，荧光显微镜检测ROS的生成情况。细胞凋亡观察： Hoechst33342染色检测细胞凋亡。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白表达水平（同上）。 （5）在细胞水平上观察外源性多胺对衰老心肌细胞自噬、线粒体损伤及细胞凋亡的影响。在此 基础上调控自噬或调控mPTP开放，探讨外源性多胺发挥作用依赖的信号级联。应用D-半乳糖诱导分 离培养的乳鼠心肌细胞衰老。在给予外源性多胺处理衰老的细胞之后，再分别给予多胺合成抑制 剂(DFMO)，自噬诱导剂 (rapamycin,Rap)，自噬抑制剂(3-MA)，自噬相关基因atg-5 siRNA， 线粒体通透转运孔开放抑制剂(Cyclosporin A,Cys A)。 线粒体通透转运孔开放诱导剂 (atractyloside,Atr) 观察其对心肌细胞自噬、线粒体功能以及细胞凋亡情况。观察指标：心肌 细胞自噬检测、心肌线粒体功能评价、细胞氧化应激评价、心肌细胞凋亡的评价。同上（4）。 （6）在分离的老龄大鼠心肌细胞及线粒体上，观察外源性多胺对线粒体膜电位、线粒体通透转 运孔（mPTP）开放的影响，以及多胺抑制剂和自噬抑制剂的干预作用，探讨多胺发挥作用的效应靶 点。应用离体心脏灌流技术分离老龄大鼠心肌细胞，应用差速离心方法分离老龄心肌细胞线粒体用 于实验。观察外源性多胺对老龄大鼠心肌细胞线粒体膜电位（m）及线粒体通透转运孔（mPTP） 开放的影响，给予多胺合成限速酶ODC的特异性抑制剂（DFMO）或自噬抑制剂(3-MA),观察抑制剂的 干预作用。观察指标： 细胞氧化损伤：DHE荧光探针标记心肌细胞，荧光显微镜下观察ROS产生。线粒体膜电位（m）变 化：JC-1染色，激光扫描共聚焦显微镜观察。线粒体通透转运孔（mPTP）开放观察：应用钙电极 检测钙诱导的mPTP开放。Calcein-AM标记线粒体，共聚焦显微镜观察mPTP开放。 2.2 2.2 研究目标研究目标 (1)本研究通过观察青年与老龄大鼠IR 与IPC心肌多胺代谢的特点与变化规律以及衰老心肌的 功能、代谢改变，拟阐明外源性多胺可通过恢复心肌细胞内多胺池重现老龄心脏IPC保护作用。 (2)给予多胺合成抑制剂、自噬抑制剂及mPTP开放剂干预，观察外源性多胺对老龄IPC心肌细胞 自噬、线粒体损伤及细胞凋亡的影响。在器官、细胞及分子水平上阐明外源性恢复老龄心肌IPC保护 作用的机制。再通过调控自噬和调控mPTP开放干预，进一步证明多胺发挥作用依赖的信号级联。 研究目标要明确、要精，提法准确恰当，内容详细但文 字不宜过多，且一定不能写得太具体。关键的问题要突 出，要有一定的难度。 第 13 页 (3)在分离的心肌细胞与线粒体水平上观察外源性多胺对老龄IPC心肌线粒体通透转运孔 （mPTP） 开放的影响，拟证明mPTP是多胺在老龄IPC心肌作用的效应靶点。 2.3 2.3 拟解决的关键科学问题：拟解决的关键科学问题： 理论关键：理论关键： （1）老龄心肌对IPC刺激的敏感性减弱或丧失是否与老龄IPC心肌ODC/多胺通路激活钝化，多胺 分解代谢增强，导致总多胺池减少有关? （2）外源性多胺能否通过恢复心肌细胞内的多胺池重现老龄心脏IPC心肌保护作用? （3）最新报道，多胺能诱导多种细胞自噬。本研究中多胺能否诱导衰老的心肌细胞自噬？如果 能，其调控的下游事件及作用的末端效应靶点是什么？这是否是其恢复老龄心肌IPC保护作用的机 制？ 以上问题的阐明，将能够验证我们提出的“多胺是介导老龄大鼠IPC心肌保护作用的信号分子， 外源性多胺通过诱导细胞自噬进而启动下游事件恢复老龄心肌IPC保护作用”的观点。 技术关键：技术关键： （1）准确测定心肌组织内的多胺（腐胺、精脒、精胺）。 （2）多胺合成与分解代谢限速酶ODC和SSAT活性测定及蛋白质表达分析。 （3）细胞自噬的检测，包括形态学观察，自噬相关基因与蛋白的检测以及能否成功沉默自噬相 关基因 (atg-5 siRNA)。 （4）心肌能量代谢、线粒体呼吸控制率变化以及线粒体mPTP开放的检测。 3拟采取的研究方案及可行性分析拟采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技术路线、实验 手段、关键技术等说明） ； 3.13.1研究方法和技术路线研究方法和技术路线 （1）在器官水平上观察青年与老年大鼠IR、IPC心肌多胺代谢变化的特点与规律 应用离体灌流大鼠心脏，复制青年（3月龄）和老年（18月龄）大鼠心肌缺血/再灌注(IR)与缺 血预适应（IPC）模型，观察青年与老龄大鼠IR与IPC心肌的多胺代谢变化规律。 可行性分析是你打动评委的第二次机会，可按成熟 的理 论 基础（理 论上可行）、研究目标在现 有技术条件下的可实 现 性（技术上可行）、本单位现 有技术设备实验材料的完 备（设备材料可行）、课题组完成课题能力（知识技能可 行）等几方面分层阐述。 第 14 页 具体步骤： Langendorff离体灌流大鼠心脏心肌IR与缺血预适应IPC模型的建立及分组模型建立: : 月龄分别为3个月（青年, 体重在200-250g）与18个月（老年,体重在450-500g）雄性Wistar 大 鼠，麻醉同时腹腔注射肝素。开胸取心脏置于冷灌流液中，主动脉逆行插管连接在Langendorff离体 灌流装置上，以80mmH2O的压力KH缓冲液灌流心脏，用95% O2和5% CO2 混合气体平衡灌流液。 实验分组（青年与老年大鼠均分为实验分组（青年与老年大鼠均分为C, IR, IPCC, IR, IPC组）：（组）：（n=8n=8） 对照组（control, C）：大鼠心脏用KH液平衡灌注180min. 缺血/再灌注组（ischemia/reperfusion, IR）：大鼠心脏先预灌平衡20min，然后在无氧、无 灌流液的条件下，保持心脏温度恒定在37oC停止灌流40min（缺血），之后再复灌120min（再灌）。 缺血预适应组（ischemic pre-conditioning, IPC）：预灌注平衡 20min 后再经历短暂的 5min 缺血，10min 再灌注，重复三次，为缺血预处理。之后心脏再经历 40min 的缺血，120min 的再灌注。 心肌多胺代谢的变化 心肌多胺含量的测定:采用苯甲酰氯柱前衍生法，反向-高效液相色谱测定心肌细胞内的多胺 （RP-HPLC，Waters, 美国）。本方法是我们实验室通过对国外测定生物样品中多胺的方法加以改良， 在国内率先建立的,文章发表在中国病生杂志2005；21（2）本人为第一作者。 心肌组织多胺合成代谢限速酶 ODC 及分解限速酶 SSAT 活性测定:用 14C 标记，液体闪烁计数仪 （LS-6500， Bechman，美国）检测心肌细胞内 ODC 与 SSAT 的活性。本方法也是我们实验室对国外 的测定方法加以优化后建立的。文章发表在中国药理学通报2005；21（5），本人为第一作者。 心肌组织 ODC 与 SSAT 蛋白质的表达 （免疫印迹法） :取左心室组织， 加入预冷的含 PMSF （lmmol/L， pH7.4）的蛋白裂解液在液氮内研磨制成匀浆，12000rpm 离心 30min，提取胞浆总蛋白。取上清，BCA 法进行蛋白质定量。蛋白质免疫印迹法检测心肌 ODC 与 SSAT 蛋白质的表达。具体方法：取 50g 总 蛋白样品于 10 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转印至 PVDF 膜，用 5%脱脂牛奶封闭后，用抗 ODC 或 根据具体研究内容 安排，可以包含多 个路线图，目的是 简洁直观合理。 第 15 页 SSAT 抗体 4 孵育过夜。加碱性磷酸酶偶联的二抗，室温孵育 40min，显色。-actin 作为一抗对 照。光密度扫描半定量分析显影条带，目的条带和-actin 信号面积之比评定其蛋白水平。 （2） 在器官水平上观察外源性多胺能否通过恢复细胞内多胺池重现老龄心肌IPC保 护作用 老龄大鼠多胺灌胃给药 6 周后复制离体灌流心脏 IPC 模型，与未给药的老龄 IPC 心脏比较，观 察外源性多胺对老龄心肌对 IPC 刺激敏感性降低或丧失的恢复能力以及对多胺池的恢复情况。再给 予多胺处理的 IPC 心脏多胺合成抑制剂(DFMO)， 观察 DFMO 是否取消了外源性多胺对老龄 IPC 心脏的 干预作用。 具体步骤： 3.3.2 2 可行性可行性分析分析 理论上可行：理论上可行： 目前已知，老龄心脏对IPC刺激的敏感性减弱或丧失，其机制尚未完全阐明。文献报道，衰老的 心肌细胞自噬能力降低，这可能是老龄心肌丧失缺血预适应保护作用的重要机制。细胞自噬减少导 致变性和损伤的蛋白质不能被清除，造成细胞损伤。相反，诱导自噬，促进细胞生存。研究显示， 随着增龄哺乳类动物多种组织器官多胺含量下降，如心脏、肝脏、骨骼肌等，多胺合成限速酶ODC 激活钝化。人和动物实验的研究均证明摄食富含多胺的食物明显降低老化相关的疾病。 我们前期的研究首次证实，缺血/再灌注损伤心肌总多胺池减少，外源性1mmol/L精胺能补充 心肌细胞内的多胺池，并通过清除自由基、降低细胞内钙、抑制细胞凋亡发挥抗心肌缺血/再灌注损 伤作用； 缺血预适应处理上调ODC/多胺通路，细胞内多胺合成增加，多胺是介导成年大鼠IPC心 研究内容和方案切忌复杂，应重视流程图。研究方法、路线、实验方案 过于具体容易发现 漏洞。但是你必须让评委认为你已经十分了解实验技 术的整个过程，可以尽可能多的应用 技术术语，写出主要实验材料和过 程。 第 16 页 肌保护作用的内源性中介分子，其作用与PKC，Erk1/2及PI3K/Akt信号转导通路的激活有关。大量文 献也报导了多胺具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、调节线粒体钙缓冲能力等多种生物学功能，尤其最新 研究发现，多胺可通过诱导酵母、线虫、果蝇及肿瘤细胞自噬延长其寿命，具有抗衰老作用。 基于以上发现，我们提出： “外源性多胺可能通过诱导自噬恢复老龄大鼠心脏对缺血预适应刺激 的敏感性”的观点。预实验初步证实了我们的推测（见后面的工作基础部分） 。从以上的研究背景和 我们预实验的研究发现来看，本课题设计在理论上是可行的。 技术上可行：技术上可行： （1）应用反向-高效液相色谱(RP-HPLC)准确测定心肌组织中多胺的方法和14C标记准确测定多 胺合成与分解代谢限速酶ODC和SSAT活性的方法为本课题负责人建立， 能够保证准确测定心肌多胺的 代谢情况。 （2）应用离体灌流大鼠心脏复制心肌缺血/再灌注与缺血预适应模型是本实验室采用的经典模 型；诱导衰老的心肌细胞模型也已成功建立（见后面的工作基础部分）。 （3）细胞自噬检测方法、蛋白质免疫印迹检测蛋白质的表达、线粒体呼吸酶复合体活性测定、 线粒体呼吸控制率与线粒体mPTP开放检测等实验技术，课题组成员均已掌握，确保完成测定。 （4）细胞转染技术本课题组成员已掌握，能够确保完成课题设计的实验。 4本项目的特色与创新之处本项目的特色与创新之处； 细胞信号分子多胺具有广泛的生物学功能