分子标记技术与植物育种

第五章分子标记技术与植物育种,遗传标记遗传基因作物育种农业生产,本章内容提要：,第一节植物育种常用的遗传标记第二节分子标记的类型及原理第三节各标记间的联系和相互转化以及高通量分子标记和自动化分析第四节分子遗传图谱的构建和比较基因组作图第五节分子标记用于基因定位第六节分子标记辅助选择,第一节植物育种常用的遗传标记,本节内容：一、形态标记（morphologicalmarkers）二、细胞学标记（cytologicalmarkers）三、生化标记（biochemicalmarkers）四、分子标记（molecularmarkers）,概念：遗传标记（geneticmarker）定义为可以稳定遗传的，易于识别的特殊的遗传多态性表现型式。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异（差异）；在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。,遗传标记的特征:1）可识别性：亲本间存在着多态性（即差异）。2）可遗传性：亲本间存在的多态性在后代中可以重演。,遗传标记的类型:形态标记，或可见标记（visiblemarkers）细胞学标记（cytologicalmarkers）生化标记（biochemicalmarkers）DNA标记（DNAmarkers）,遗传标记应具备的条件：多态性高；表现共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型；对主要农艺性状影响小；经济方便，容易观察记载。,遗传标记的用途：（1）遗传研究：连锁分析、基因定位、遗传作图、基因转移和多样性分析等。（2）植物育种：辅助选择。在作物育种中，通常把与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用于对目标性状进行追踪选择、辅助选择以及基因型鉴定。,遗传标记的发展：,形态标记：简单性状的遗传（普通遗传学）；细胞学标记：染色体变异与细胞学特征（细胞遗传学）；同工酶标记（蛋白质标记）：同工酶与电泳技术（生化遗传学）；分子标记：DNA序列变异与检测技术（分子遗传学）：,一、形态标记,形态标记：指植物的外部形态特征，是一类容易观测，使用广泛的标记。典型的形态标记用肉眼可以识别和观察，也叫可见标记（visiblemarkers），是指在个体上可以看见的遗传标记，如花色（红花、白花）、株高（高秆、矮秆），还有叶形、果色等性状通过观察即可作出判断。广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识别的某些性状，如生理生殖特性、抗病虫性等。,如：水稻部分形态标记及标记基因,形态标记材料的获得方法：一般通过自然突变、物理或化学诱变来获得具有特定形态特征的遗传标记材料。标记与基因的连锁分析方法：通过两点、三点测验来确定标记基因与目标性状之间的关系。利用已知位点的标记定位未知位点的新标记。形态标记的实质：利用一个性状来推论另一个性状，或利用一个性状来推论它的遗传基因,形态标记的利用：大麦中抗杆锈与抗散黑穗病基因连锁，选一个可连带另一个基因。棉花芽黄与核雄性不育基因共分离，苗期可以鉴别可育株和不育株用于制种。形态标记曾经发挥过很大作用，但其标记的数量少、周期长、多态性差、易受环境影响。因此，在育种中应用是非常有限的。,二、细胞学标记,细胞学标记：即能明确显示遗传多态性的细胞学特征。研究表明：染色体的数目和结构的变化，包括单、缺、三、四体；缺失、易位、倒位、重复；核型（染色体数、大小、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）都会引起某些表型性状的变异。因此，可作为一种遗传标记加以利用。,染色体结构和数量的直接分析方法：染色体核型分析和染色体带型分析。染色体核型：染色体数目、大小、随体有无、着丝粒位置等核型特征指染色体的长度、着丝粒位置和随体有无,后期染色体的形态,染色体的数量特征：细胞中染色体数目的多少染色体数量上的遗传多样性整倍性变异：单倍体、多倍体非整倍性变异：缺体、单体、三体、端着丝点染色体等,物种染色体数目（2n）人类Homosapiens46小家鼠Musmusculus40果蝇Drosophilamelanogaster8小麦Triticumvulgare42水稻Oryzasativa24豌豆Pisumsativum14链孢霉Neurosporacrassa7衣藻Chlamydomonasreinhardi16,用具有染色体数目和结构变异的材料与染色体正常的材料杂交，其后代常导致特定染色体上的基因在减数分裂过程中的分离和重组发生偏离，由此可以测定基因所在的染色体及其相对位置。因此染色体数目和结构的特征可以作为一种遗传标记。染色体数目和结构变异常具有相应的形态学特征，因此可以提高这些标记的鉴定和利用效率。,如：水稻IR36初级三体的形态特征,又如：小麦和黑麦杂交创造的1RS/1BL易位系，在1RS上携带有抗锈病和抗白粉病等基因。根据1RS/1BL染色体在小麦背景中不呈现次缢痕，看不到随体，1RS特有的C带带型等细胞学证据，可以判断后代是否携带有所需要的来自黑麦的抗性基因。,染色体带型：C带、N带、G带等带型特征指染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等，可以反映出常染色质和异染色质的分布。染色体的分带技术：G带：用吉姆沙（Giemsa）染色产生的带；Q带：用荧光染料染色产生的带；R带：与G带相反的带；C带：显示组成型异染色质的带。,人类细胞遗传学高分辨显带命名国际体制（1980）：染色体的短臂以p表示，长臂以q表示；每个臂再划分为区（region）；每个区再划分为带（band）。例如，12p14代表第12染色体短臂上第1区第4带，而9q34代表第9染色体长臂上第3区第4带。,带型特征,细胞学标记的优缺点：优点：细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点缺点：（1）费时、费力，材料的获得需要花费大量的人力物力进行培育；（2）某些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，甚至不适应而死亡，耐受性较差，难以获得相应的标记材料；（3）有些标记伴有对生物有害的表型效应；还有些标记的鉴定比较困难，虽能把基因定位在某染色体上，但仍不能精确定位；（4）可资利用的标记数量有限,三、生化标记,生化标记：易于识别的蛋白质或酶的生物学特征，是以基因表达产物为主的一类遗传标记系统。可分为酶蛋白和非酶蛋白两种，酶蛋白一般是指同工酶（Isozyme）或等位酶（Allozymes）。通常利用淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）和酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（APAGE）来分离检测。,种子贮藏蛋白标记：种子贮藏蛋白的种类：包括白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白等原理：不同品种蛋白的结构和数量不同；方法：蛋白PAGE电泳法利用：种子纯度鉴定，品种识别等,同功酶及等位酶标记同功酶是指具有相同催化功能而结构及理化性质又不同的一类酶，其结构的差异来源于基因类型的差异，因此并不一定是同一基因的产物。等位酶：是同一座位上的不同的等位基因引起的利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶谱。,同功酶标记是一种共显性标记,水稻部分同工酶基因同工酶基因座位染色体等位基因酸性磷酸酯酶Acp-1120-3Acp-2120,3Acp-471,2乙醇脱氢酶Adh-1110-3-淀粉酶Amy-170-3过氧化氢酶Cat-160-3酯酶Est-260,1,2Est-391,2Est-510,1,2Est-770,1Est-971,2资料来源：RiceGenet.News.Vol.7。,优点：蛋白质标记是基因表达的产物，与形态和细胞学特征相比，数量上更丰富，可直接采集组织、器官等少量样品分析，克服了整株直接取样的缺点，直接反应基因产物的差异，受环境影响小。不足：标记的数量还是比较有限，特别是酶蛋白标记需要特殊的显色方法和技术；某些酶的活性具有发育和组织特异性；或仅局限于反映基因组编码区的表达信息等。,生化标记的优缺点：,形态标记、细胞学标记、生化标记存在的问题是：,这些标记在数量上都是有限的。虽然经过近百年的努力，目前这些标记的数量仍然不多，因此限制了这些标记的利用。细胞学和生化标记在操作上比较麻烦，难以开展大规模的研究和利用。,四、分子标记,广义的分子标记是指可遗传的、并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义的分子标记仅指DNA标记，是以染色体DNA上特定的核苷酸序列作为标记。分子标记是直接反映DNA水平上的遗传多态性的标记，表现为核苷酸序列的任何差异。,分子标记的种类非常多！,RFLP:RestrictionFragmentLengthPolymorphisms（限制性片段长度多态性）VNTR:VariableNumberofTandemRepeats（可变数目的串连重复序列标记）RAPD:RandomAmplifiedPolymorphicDNA（随机扩增多态性DNA）DAF:DNAAmplificationFingerprinting（DNA扩增指纹）,SSR:SimpleSequenceRepeatsSCAR:Sequence-characterizedAmplifiedregionsSTS:SequenceTagSiteAFLP:AmplifiedFragmentLengthPolymorphismsCAPS:CleavedAmplificationPolymorphismSequence-taggedSitesSNP:SingleNucleotidePolymorphismsEST:Expressedsequencetags,分子标记的优越性：直接以DNA的形式表现，不受季节、环境限制，不存在是否表达的问题；数量多，遍及整个基因组，检测位点近乎无限；多态性高，自然界存在许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；表现为“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多分子标记表现为共显性，能鉴别纯合或杂合的基因型，提供完整的遗传信息。,应用：遗传图谱构建；系统发育关系分析；种质资源分类鉴定；品种注册、专利保护、病毒鉴定；基因定位、体细胞杂种鉴定；分子标记辅助育种选择,第二节分子标记的类型及原理,依据对DNA多态性的检测手段的不同，DNA分子标记大致可分为三大类：一、基于分子杂交技术的分子标记二、基于PCR技术的分子标记三、基于DNA芯片技术的分子标记,一、基于分子杂交技术的分子标记,1、RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism），译为限制性片段长度多态性，是基于DNA序列上的变化而造成限制性内切酶的酶切位点的增减，或限制性酶切片段长度发生变化。RFLP分析是限制性内切酶、核酸电泳、印迹（blot）技术、探针杂交技术的综合应用。RFLP是出现最早，利用最广的一种分子标记，特别在遗传图谱构建的应用。,发展历史：RFLP标记在20世纪70年代被认识，随着分子杂交、放射性自显影技术的完善；到1980年，人类遗传学家Botstein等构建了第一张病毒的RFLP遗传图谱；1987年Donis-keller构建了第一张人类的RFLP遗传图谱；以后在微生物、植物、动物和人类上都得到了广泛的利用。目前，该技术已广泛应用于遗传图谱的构建、基因定位、遗传进化研究、标记辅助选择等,RFLP基本原理是：利用特定的限制性内切酶（restrictionenzymes，RE）消化不同生物个体的基因组DNA，得到许多大小不等的DNA片段，反映DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离这些片段后，将其按原来的位置顺序转移到尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用经放射性同位素或非放射性物质标记过的探针与之杂交，若某一位置上的DNA酶切片段与探针有同源性，通过碱基互补，标记好的探针就结合到这个位置上，经放射自显影或酶学检测，可显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性情况，即形成不同带谱，反映个体特异性的RFLP图谱。,基本步骤：,基因组DNA,酶切DNA,琼脂糖电泳,Southern转移,DNA预杂交,DNA探针,放射性标记探针,放射性自显影,分子杂交,DNA提取：选取适当的生物体样品（生长旺盛、黄化苗），液氮中研磨，加入DNA提取液（Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS、CTAB等），充分提取后，加入抽提液（酚、氯仿、异戊醇）混匀离心除去蛋白质，加入RNA酶除去RNA，再用乙醇沉淀DNA，TE溶解，即可使用或-20保存备用。,限制性片段的产生：取出适量样品DNA，加入buffer，用相应的限制性内切酶消化DNA。不同的限制性内切酶消化同样的基因组DNA时，结果不同；同样的限制性内切酶消化不同的基因组DNA时，结果也不同。,酶切示意图：,CharacteristicsofSomeRestrictionEndonucleasesNumberofCleavageEnzymeOrganismfromwhichRecognitionSequenceSitesinDNAfrom:NameEnzymeislocatedandPositionofCutpBR322BamHIBacillusamyloliquefaciensH5GGATCC3513CCTAGG5BglIIBacillusglobigiAGATCT50TCTAGAEcoRIE.coliRY13GAATTC51CTTAAGHindIIIHaemophilusinfluenzaeRdAAGCTT61TTCGAAPstIProvidenciastuartiiCTGCAG181GACGTCSalIStreptomycesalbusGGTCGAC21CAGCTGHaeIIIHaemophilusegyptiusGGCC5026CCGGHhaIHaemophilushemolyticusGCGC5031CGCG,电泳（electrophosis）：载体：电泳用的凝胶由琼脂糖（agarose）制备，琼脂糖的浓度通常为0.9-1.0%。作用：酶切后的DNA样品通过电泳，使DNA片段分离,并按分子量的大小排列。,Southernblotting：印迹转移是由E.M.Southern于1975年发明的，故名。DNA从凝胶转移到特制的杂交膜上（硝酸纤维尼龙膜）。杂交膜的制备：DNA从凝胶转移到特制的杂交膜上，常用HybondN+（Amersham）的尼龙膜。凝胶的处理：脱嘌呤处理：0.25MHCl变性处理：0.4MNaOHDNA转移：转移液：20 xSSC缓冲液（和NaOH溶液）洗膜：洗膜液：2xSSC缓冲液,探针的制备用于RFLP分析的探针（probe）是DNA片段，长度约0.5-2.5kb。探针的来源有：基因组的随机片段、cDNA等。高度的保守性，即它的同源序列不能太多。探针以克隆的方式保存，以质粒（plasmid）为载体，如pUC19等，通过大肠杆菌繁殖。探针的标记(labeling)：利用放射性同位素（32P-dCTP）等对探针进行标记，以跟踪探针。同位素标记探针的获得方法：利用DNA聚合酶（Klenow），在DNA复制的过程中，把32P-dCTP合成到DNA片段上。,DNA杂交：预杂交:（用非特异性DNA分子将待测核酸分子中的非特异性位点封闭）杂交液+鲑精DNA(shearedsalmonspermDNA,SSSDNA)杂交液:20XSSPE250ml100XDenhardts50ml10%(w/v)SDS50mlMakeupto1000ml65C保温，2小时以上。,杂交:把经预杂交的杂交膜放到已加入探针杂交液中。65C过夜。洗膜：洗掉没有杂交上的探针A.2XSSC,0.1%SDS，65C，20min；B.1XSSC,0.1%SDS，65C，20min；C.0.5XSSC,0.1%SDS，65C，20min,放射性自显影包膜:用塑料薄膜把已杂交的杂交膜包起来。放入暗盒中。照射：放入X光片，紧压。-80C冷柜中曝光2-4天。显影：在暗房中取出X光片，显影、定影、冲冼。,一张杂交膜可以用多个探针去杂交,同样的探针，不同的RE,结果差别很大,以cphy5作探针得到的放射自显影图谱所用限制性内切酶为Hpa和Msp。水稻品种:1、农垦58;2、农垦58S(幼苗);3、农垦58S(育性转换期);4、W6154S。右侧为分子量标记K2EcoRI+Hind,RFLP图谱代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生的片段在长度上的差异。特点：无表型效应，重复性好，不受发育阶段或器官限制，不受基因互作影响，数目几乎是无限的；共显性；具有种族特异性；遍及全基因组。不足：所需DNA量大；步骤繁琐，所需仪器设备多，周期长；探针制备和保存麻烦、成本高；易造成环境污染。目前，RFLP很难直接用于育种。,2、VNTR（Variablenumberoftandemrepeats），称作重复数可变串联重复。许多生物体的DNA存在含有大量串联重复序列的高变异区，以1575个核苷酸为基本单元的串联重复序列称为小卫星（minisatellites）；以26个核苷酸为基本单元的简单串联重复序列称微卫星（microsatellites）或简单序列重复（SSR）。,VNTR的多态性是由于同一座位上的串联单元数量的不同而产生的。许多小卫星序列太长，无法通过PCR扩增获得满意结果，仍需利用DNASouthern杂交和放射性标记探针来检测，实验过程与RFLP一样，只是探针序列选择不同。这里指的VNTR主要指小卫星标记，SSR归类于基于PCR的标记，在后面讲述。,3、原位杂交，即ISH（InSituHybridization）染色体原位杂交技术是DNA探针与染色体上的DNA杂交，在染色体上直接进行检测的分子标记技术，是联系细胞遗传学与分子遗传学的纽带。它通常用同位素或生物素，如：地高辛或荧光素标记的探针与染色体DNA杂交，通过放射自显影或抗原抗体反应，在荧光显微镜下观察DNA探针与其互补的DNA序列结合的位置。探针DNA通常是高度重复的串联或散布的物种专化DNA序列或外源物种总基因组DNA，或单拷贝、低拷贝序列。,ISH主要用于外源物质（染色质）的检测，如DNA序列或基因的物理定位；用于研究染色体组间的部分同源关系，或物种进化，以及亲缘关系；或用于分析导入不同核背景中染色质的定位、行为表达及结构等。,二、基于PCR技术的分子标记,PCR(polymerasechainreaction)即聚合酶链式反应，是一种DNA体外扩增，是由美国Cetus公司人类遗传实验室的MullisK.B.等人于1983年发明的。PCR发明的故事:PCR发明是一件有趣的事，对科学工作者很有启迪。,PCR发现的几个重要事件：1983年12月16日，第一次成功地完成PCR实验；（这个春天时的想法，经过三个月断断续续的实验，终于在圣诞节前成为现实）1984年，申请发明专利；1985年，在Science上发表简短的报导；1986年，在美国冷泉巷实验室年会上报告；1987年，完成PCR的自动化装置（PCR仪）；1991年，与DuPont公司对簿公堂；1993年，获诺贝尔奖。,与DuPont对簿公堂：1987年，DuPont找Cetus，希望获得PCR的授权。Cetus说“不”。1991年，正当“沙漠风暴”席卷伊拉克时，DuPont与Cetus在加利福尼亚联邦法院的法庭上，摆开了对阵的架势。DuPont认为，PCR早就发明了，PCR的发明权不属Cetus。,DuPont的证据主要是：（1）Kornberg早在1957年就发现了聚合酶。Kornberg出庭作证，那时谁想做PCR都能做，Mullis只是第一个需要做这种试验而已。（2）Kleppe于1971年提出了体外合成DNA的原理。（3）Panet等1974年对DNA体外复制作了描述，并有做试验的打算。Cetus反驳：（1）Kornberg在1983年出版的DNA复制教科书，并没有关于PCR的论述，说明那时还没有这方面的知识。（2）到1989年，关于PCR的文章有2000多篇，没有1篇怀疑PCR是在1985发展起来的。审判持续了两个月。最后，Cetus以58票对0票胜诉。,由于每一周期所产生的DNA均能成为下一次循环的模板(template)，所以PCR产物以指数方式增加，经过2535次周期之后，理论上可增加109倍(230=107109)，实际上至少可扩增105，一般可106107。,PCR技术的基本原理:,PCR原理示意图,其主要步骤是:高温变性(Denaturation)(94C)：置待扩增DNA于高温下解链成为单链DNA模板。低温退火(复性)(Annealing)(3065C)：引物与模板结合，为延伸奠定基础。人工合成的两个寡聚核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合。适温延伸(extension)(6575C)：DNA聚合酶在72C将单核苷酸从引物3端开始掺入,沿模板53方向延伸，合成DNA新链。,TaqDNA聚合酶：在PCR中，最初使用的是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。由于该酶不能耐受反应循环中解链所需的高温（93C-95C），因此在反应过程中必须不断补加聚合酶以满足每次扩增的需要。这样造成操作繁琐，反应低效及费用增加。另一方面，由于Klenow片段聚合反应温度低（37C），容易形成引物与DNA模板的非专一性配对，或受某些DNA二级结构干扰，结果产生许多非专一性的产物带。,Taq酶的性质：TaqDNA聚合酶是从生长在温泉中的水生栖热菌（Thermusaquaticus）中分离纯化出来的。这种栖热菌能在70C-75C中生长。TaqDNA聚合酶的分子量为93.9kD，活性可达200,000U/mg蛋白。TaqDNA聚合酶的功能是：在有四种核苷酸三磷酸盐的反应系统中，以高温变性的DNA为模板，从分别结合在模板DNA两端的引物为出发点，按53的方向，沿着模板顺序合成新链。TaqDNA聚合酶具有较高的热稳定性。以实验为证，将反应系统分别置于92.5C、95C、97.5C，分别经过130分钟、40分钟和5-6分钟后，TaqDNA聚合酶的活性仍保持50%。,TaqDNA聚合酶的特性,影响酶活性的因素：温度：虽然TaqDNA聚合酶有很强的温度适应范围，但高于90C的环境仍会使部分酶变性失活。反之，如果温度过低，不但酶活性受影响，而且由于引物在低温下(特别是25C-27C)可能与基因组中别的部分同源的序列结合，使得一些扩增产物并非为目的序列。适当提高温度，错配碱基多会解离，反应产物的特异性增加。TaqDNA聚合酶的最适应温度为70C。Mg+的浓度：TaqDNA聚合酶活性对Mg+的浓度非常敏感。TaqDNA聚合酶与其它聚合酶一样，是Mg+依赖性酶。测定表明，在MgCl2为2.0mM的条件下，酶的活性显示最高。K+的浓度：KCl的最适浓度是50mM，高于75mM时，聚合反应受到明显的抑制。,PCR反应液（例子）:10 xPCRbuffer2.515mMMgCl22.5(可变)1mMdNTP5.0Taq(1u)1.0(可变)Primer(100ng/l)1.0 x2GenomicDNA(20ng/l)5.0H2O7Total25.0(l)10 xPCRbuffer：500mMKCl200mMTris-HCl（pH8.2）0.01%gelatin,基于PCR技术的分子标记，根据引物的不同，分为随机引物的PCR标记和特异引物的PCR标记，也可细分为：单引物PCR标记，如RAPD、APPCR、DFA、ISSR等；双引物选择性扩增的PCR标记，如AFLP；需要通过克隆，测序来构建特殊双引物的PCR标记，如SSR；序列特征化扩增区域（如SCAR）和序标位（如STS）等。,1、RAPD（RandomamplifiedpolymorphicDNA），译为随机扩增多态性DNA该技术是在1990年由Williams等人以PCR聚合酶链式反应为基础提出来的。它是利用任意寡聚脱氧核苷酸单链的片段（810bp）为引物，通过PCR扩增染色体组中的DNA，所获得长度不同的DNA片段，通过电泳分离后，经染色显示扩增片段的多态性。它反映因碱基突变而引起引物结合位置变化，或在引物结合位点间因DNA的插入或缺失而引起的扩增片段长度的变化。,RAPD的基本原理与PCR技术原理相同，是随机扩增的PCR技术，与一般PCR的主要差异是利用随机引物。引物通常是10核苷酸的长度，引物是随机设计的，因此利用RAPD引物通常可以从基因组中扩增出多个DNA片段。RAPD的带型通常为显性。,A-01CAGGCCCTTC,53,35,AB,CD,DACB,若位点2处碱基发生改变，则:,随机引物BA2142扩增的RAPD条带1.marker;26.冬油菜;714.南方油白菜;1521.春油菜,PrimerSagon230PrimerSagon293花生12个品种DNA用随机引物S230和S293的扩增图谱注:M=PCRMarkers，112=peanutcultivars,RAPD的优点：不需DNA探针，技术简单，操作自动化程度高，检测快速，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；所需DNA样品量少，对样品DNA质量要求低；引物无种族特异性，即不依赖于种属特异性和基因组结构；引物价格便宜，成本较低；设计引物也无须知道DNA序列信息。,RAPD的缺点：通常是显性标记，极少数共显性，不能鉴别纯合子与杂合子；存在共迁移，只能分开不同长度DNA片段，不能分开长度相同而碱基序列不同的片段；影响因素多，如：templateDNA、primer、Mg2+等，稳定性和重复性差，结果可靠性较低。,与RAPD相似的还有：APPCR和DAFAPPCR：引物较长，1050bp，扩增的条带比RAPD少，但结果相对比较稳定；DAF：引物较短，58bp，扩增的条带比RAPD多，结果更不稳定！,RFLP具有分子标记较多、多态率高、共显性等优点，可以对整个基因组作指纹分析，但其技术较为复杂。,PCR具有技术比较简单，适应大量自动化作业，但特异性引物不易发展，数量有限，难以用作指纹分析。,AFLP,RFLP和PCR的技术都有许多优点，但也都存在一些不足之处。,2、AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism），译为扩增片段长度多态性。是荷兰Keygene公司的科学家ZabeauMarc.和VosPieter.发明创造的一种DNA分子标记。该技术是对限制性酶切片段进行选择性扩增，故又称为基于PCR的RFLP。AFLP的多态性极高，一次可以检测到100150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及进行分类研究。Keygene公司于1992年12月16日向欧洲专利局提出SRFA（Selectiverestrictionfragmentamplification）作为DNA指纹分析（DNAfingerprinting）的方法的专利申请。专利于1993年3月公开，并引起了各国相关实验室的深厚兴趣。1995年，VosP.等人在核酸研究（NuclAcidsRes.）上发表第一篇有关AFLP的论文。,AFLP原理：用两种能产生黏性末端的限制性内切酶对基因组进行双酶切，将酶切片段和含有与其黏性末端互补的已知序列的接头连接，形成带接头的特异片段用作随后的PCR反应模板，所用引物5端与接头及酶切位点序列互补，3端添加13选择性碱基，用该引物选择性地识别具有特异配对序列的酶切片段，实现特异性扩增。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，用放射性方法、荧光方法或银染方法染色观察。,AFLP的基本原理：（1）双酶切（2）对特定片段进行扩增；（3）电泳（4）染色或自显影PCRamplificationofgenomeDNAafterdigestionwithtworestrictionenzymesandligationofanadapterofaround20basepairs.Theprimersaremadeupoftheadapterplus3randombaseaddedatthe3end.,基因组DNA双酶切5.CTGCAGTTAA.33.GACGTCAATT.5GTACGTCAAT5两端加上与内切酶产生的粘性末端互补的人工接头PstI接头MseI接头CTCGTAGACTGCGTACATGCAGTTACTCAGGACTCATCATCTGACGCATGTACGTCAATGAGTCCTGAGTAGCAGMseI引物？AATGAGTCCTGAGTAGCAGCTCGTAGACTGCGTACATGCAG.TTACTCAGGACTCATCATCTGACGCATGTACGTC.AATGAGTCCTGAGTAGCAGCTCGTAGACTGCGTACATGCAG？PstI引物,ABC,ABC,BCA,BCA,Amplifiedfragmentlengthpolymorphisms,从广义来说，PCR以及由PCR产生的相关方法如RAPD等产生的多态性都是AFLP（扩增性片段长度多态性）。这里讲的AFLP指的是SRFA（Selectiverestrictionfragmentamplification）。限制性片段的设计：SRFA的主要目的是指纹分析。指纹分析要求从基因组中快速产生较多的带。从基因组中快速检测出较多的带通常是使用测序胶进行的。测序胶是聚丙烯酰胺凝胶，最有效的分离片段约100bp-500bp。因此，为了达到最好的分辨效果，用于SRFA的限制性片段应主要为100bp-500bp。,限制性酶的选择（两种酶）：前面已经介绍过限制性酶。这里需要考虑的是，用什么限制性酶能使基因组酶切后，大多数片段在100bp-500bp的长度。经过估算和试验，选用一个6-bp识别位点的酶和一个4-bp识别位点的酶，同时处理DNA后能达到这一效果。通常，在SRFA实验中，6-bp识别位点的酶选用PstI，而4-bp识别位点的酶选用MseI。两种内切酶：一种为酶切频率较高的RE(frequentcutter)，4bp。其主要作用是为了产生易于扩增，在测序胶上能较好分离的、合适大小的DNA片段；一种为酶切频率较低的RE(rarecutter)，6bp。主要作用是用来限制用于扩增的的模板DNA片段的数量。引物的结合点是依据它的酶切点的碱基序列设计的。,接头的设计和连接：接头（adapter）是人为设计的、连接到内切酶产生的粘性末端上，即限制性片段两侧的一小段DNA序列上。它的作用是为设计引物提供已知的碱基序列。是引物与模板的结合点。设计接头的原则是：（1）接头必须能连接到酶切位点上。（2）接头的两条寡核苷酸链应能互补，形成双链结构。（3）接头的碱基序列应符合引物设计的要求。接头的连接是利用T4DNA连接酶，把接头与限制性片段连接起来，每个限制性片段的两侧分别连接两个不同的接头。连接后，接头成为模板DNA的一部分。,非选择性引物的设计和非特异性扩增：SRFA所用的引物是根据接头的碱基序列合成的。引物序列的方向是53，它应能与接头的35链互补。因此，非选择性的引物，实际上就是接头的53链。由于限制性片段由两种限制性酶产生，连接着两个不同的接头，因此也有相应的两个不同的引物。由于两个引物与限制性片段两侧的接头一样，因此凡连接有接头的模板都可以作为模板，因此扩增是非特异性的。扩增的方法与通常的PCR方法是相似的。,选择性引物的设计：由于非选择性扩增产生数十万个不同的产物，扩增产物电泳后显示不出带纹。因此必须对非选择性扩增产物再进行选择性扩增，从中扩增出有限的产物，通常是几十个产物，才能显示出能区别的带纹。选择性扩增的选择性效果取决于引物中选择性碱基的数目：选择性碱基数目选择的模板DNA（已连接接头的模板）11/16（1/4x1/4）21/25631/4,09641/65,536n1/42n（4nx4n）,Selectiverestrictionfragmentamplitication,引物E2TG/M2CTG对20个水稻品种的AFLP分析通过聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过放射自显影显带。,AFLP特点：结合了RFLP的稳定性和PCR技术高效性的优点；不需预先知道DNA序列的信息；酶与选择性碱基的组合类型多，理论上产生的标记数是无限的；多态性最丰富，一次可检测到50100条扩增产物；共显性/显性，无复等位效应，表现孟德尔遗传；模板用量少，对模板浓度变化不敏感；扩增片段短，分辨率高；假阳性低，可靠性高；大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应，可用于分析基因组的位标和联系二者的桥梁；受专利保护，成本高，对DNA的纯度及内切酶质量要求高，通常需要使用同位素或非同位素标记引物（不足之处）。应用：非常适合绘制品种指纹图谱和分类研究。,3、SSR（simplesequencerepeat），即简单重复序列又称微卫星DNA，是一类由16个碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，广泛分布于基因组的不同位置上。其原理：重复长度具有高度变异性，但其两端的序列是相对保守的单拷贝序列，根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异性引物，利用PCR技术扩增每个位点的DNA序列。通过电泳分析核心序列的长度多态性。,引物的设计：微卫星标记是通过对微卫星序列作特异PCR扩增产生的。对微卫星序列作特异PCR扩增，需要根据微卫星两侧的序列设计引物，这种引物是特异性的，即在基因组中是独一无二的。设计引物的前提是要知道引物所在座位的DNA序列。因此，微卫星两侧DNA的测序便成为微卫星标记发展的最大限制因素。,SSR标记的主要特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异，多态性高；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子（4）所需DNA量少，实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，即必须克隆足够数量的SSR并进行测序，根据测序结果设计相应的PCR引物，因此对一些植物，其开发有一定困难，费用也较高。,各类微卫星的频率在不同的生物体之间存在着显著的差异。在人类基因组中，最丰富的微卫星是(AC)n和(GA)n。(AT)n是植物基因组中最丰富的微卫星。在水稻基因组中，最丰富的微卫星是(GA)n和(GT)n。不同生物的基因组中，微卫星的丰度也差异较大。哺乳动物基因组中微卫星的丰度约为植物基因组的5倍。在植物中，双子叶植物微卫星的丰度约为单子叶植物的3倍。,EstimatednumberofSSRinthericegenome,SSLP(simplesequencelengthpolymorphism)即简单序列长度多态性，是由于简单序列的重复次数不同，导致扩增片段长度的不同而产生的多态性。在微卫星DNA中，简单序列的重复次数在同一物种的不同品种或不同个体中存在着较大的差异。微卫星座位上存在着非常丰富的等位基因。例如，在水稻中，RFLP座位的等位基因数为2-4个，而微卫星的等位基因数为2-25个。从多态性信息含量（polymorphisminformationcontent，PIC）来衡量，RFLP的PIC值为0.39，而微卫星的PIC为0.69。由于微卫星座位具有丰富的等位基因，因此微卫星标记是一类比较理想的分子标记。,SSR应用：遗传图谱的构建、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测，以及目标性状基因标记筛选等。目前在SSR基础上又开发成功一种新的分子标记ISSR。ISSR具体做法是用结合于两个相邻SSR区域内的引物去扩增它们中间的单拷贝序列，然后通过电泳检测其扩增产物的多态性。引物设计采用2个、3个或4个碱基为基序，以其不同重复次数再加上几个非重复的锚定碱基组成随机引物，从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5或3端结合，通过PCR反应扩增两个SSR之间的DNA片段。,4、SCAR，即序列特异扩增区域基本做法：对RAPD多态性片段克隆，并对克隆片段两端测序，根据测序结果设计长度为1824bp的引物，一般引物前10个碱基应包括原来RAPD扩增所用的引物，以此特异引物对基因组DNA再PCR扩增，便可扩增出与克隆片段同样大小的特异带。特点：稳定性和重复性好；共显性。若待检DNA间的差异仅表现为扩增片段的有无，可直接将溴化乙锭加入PCR反应管中，在紫外灯下观察有无荧光来判断有无目标产物。这在分子标记追踪选择方面极为方便。,5、CAPs，即酶切扩增多态性序列用特异设计的PCR引物扩增目标DNA时，如果由于特定位点的碱基突变或插入、缺失数很少而导致检测不出多态性时，往往需要对相应的PCR扩增片段进行酶切处理，以检测其多态性，即CAPs。其最成功的例子是用CAPs标记成功构建拟南芥遗传图谱。,6、STS，序列标签位点或简称序标位是对以特定引物序列进行PCR扩增的一类分子标记的统称。STS引物的获得主要来自RFLP单拷贝的探针序列、微卫星序列、表达基因序列以及YAC或cosmid的插入末端序列。优点：共显性遗传；很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记比较，是沟通遗传图谱和物理图谱的中介；确定物理图谱及DNA片段排列在染色体的位置。,7、基于PCR的其它分子标记EST，表达序列标签：ProteinmRNAcDNA用作探针分子杂交鉴别出与转录有关的基因。或用与mRNA多聚A尾巴互补的寡聚T或克隆载体的相关序列为引物，对mRNA双端尾侧的几百个碱基进行测序，得到EST。RGA，抗病基因类似物：不同植物的不同抗病基因都具有一些共同的保守序列，依据这些保守序列设计特异性引物来扩增基因组DNA可获得抗病基因类似物片段。,三、基于DNA芯片技术的分子标记,SNP，单核苷酸多态性，是指不同个体基因组DNA序列之间单个核苷酸的差异，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入或缺失，是目前能够覆盖基因组所有DNA多态性的唯一标记方法。目前，搜寻SNP最普遍方法是将已定位的序列标记位点（STS）和表达序列标记（EST）进行在测序。此外，基于公共数据库的直接方法来寻找新的SNP。,SNP技术基础是基因组的全面测序，检测的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片技术。DNA芯片又称生物集成模片、DNA陈列或寡聚核苷酸微芯片，它是由几百到几千个核苷酸片段预先设计的排列方式固定在载玻片上或尼龙膜上而组成的密集的分子排列。,几种分子标记特点的比较标记类型带型等位基因数杂合度稳定性技术难度费用RFLP共显性中(4.8)0.63高难高RAPD显性少(2.0)0.36低易低AFLP显性少(2.0)0.34稍低难高SSLP共显性多(6.8)0.72高易低注：表中数字来自PejicI.,etal.,TAG(1998)97:1248-1255.,Subjectiveviewofthechangingrelativeimportanceofdifferentmolecularmarkers.Thehorizontalaxisindicatestime.Ateachtimepoint,theverticalaxiscorrespondstothetotaluseofmolecularmarkers.Ifmorethanonemolecularmarkerisusedatagiventimepoint,itsrelativeimportanceisreflectedbyitsproportionontheverticalaxis.,RFLP,SSR,RAPD,SNP,AFLP,DNAsequencing,第三节各标记间的联系和相互转化以及高通量分子标记和自动化分析,一、各标记间的联系和相互转化二、高通量分子标记和自动化分析技术,一、各标记间的联系和相互转化,分子标记要用于作物育种中进行辅助选择，必须将各种标记与简单、快捷、准确、高效、低耗费的PCR标记接轨。SSR、STS、SCAR等就是采用特异PCR引物扩增而来，属于PCR标记，其它标记都可转化为PCR标记。目前，成功的分子标记间转化，特别是转化成成功的PCR标记的实例还不太多，原因要么是多态性没有得到提高；要么是存在共迁移而无法区分长度相同而碱基序列不同的片段；要么是需要克隆、测序等工作而消耗大量人力、财力和时间。,二、高通量分子标记和自动化分析技术,理想的分子标记在信息量和检测技术方面应有较强的优势，检测的变异范围或数目应当是无限制的，那么就要符合以下要求：多态性高；共显性遗传；能明确辨别多个等位基因；除特殊位点的标记外，应遍布均匀分布于整个基因组；选择中性即无基因效应；检测手段简单、快捷；成本低、重复性好。,采用单一分子标记同时作单位点与多位点分析，目前还不能协调一致。如多位点分析（RAPD、AFLP）简单高效，但在准确估计等位基因频率或杂合度时较困难；单位点分析（RFLP）结果可靠，但工作效率低，不能作大规模分析。在许多研究领域，如QTL定位、系统演化、分子进化等，都涉及大量的分子标记分析。因此，要求发展高通量的分子标记。高通量分子标记是指在单位时间和处理中能提供大量遗传信息的分子标记。自动化分析可能为高通量分子标记提供出路。,目前自动化分析系统有：多重PCR，利用不同荧光标签（如Cy5）等标记多对引物进行PCR扩增；多重点样，将多个PCR产物上样于同一电泳道来增加信息量；多色荧光标记系统的使用，降低试剂量成本；使用荧光自动测序仪，开发特定软件包；DNA芯片技术。待研究的其它方法：质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方阵检测、乳胶凝集反应、直接电荷变化检测等。,第四节分子遗传图谱的构建和比较基因组作图,分子遗传学发展和分子标记技术建立，为植物育种注入更深内涵，如分子标记辅助选择时高效；通过比较基因组研究，借助一种物种中发现的优异基因推及另一物种中发掘并应用。一、分子遗传图谱的构建二、比较基因组作图,一、分子遗传图谱的构建,遗传图谱：指基因组内基因以及专一的多态性DNA标记在染色体上线性排列的相对应位置的图谱。分子遗传图谱是基于传统的遗传作图的基础上发展而来的。遗传作图(Geneticmapping)即遗传图谱的构建。它是利用遗传学的原理和方法，构建能反映基因组中遗传标记之间遗传关系的图谱。即遗传标记连锁图。或者是：制作遗传标记连锁图。,（一）图谱构建的理论基础,1、染色体遗传理论（WSSutton&TBoveri,1903）体细胞中染色体成对存在，两个成员是同源的；在生命周期中，染色体保持结构上的恒定性和遗传上的连续性；在减数分裂中，同源染色体的两个成员相互配对，随后又发生分离，走向细胞的两极，从而形成两个单倍体性细胞。,2、基因重组和连锁理论（1）细胞减数分裂中，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合；同源染色体上的基因产生交换和重组，交换的频率随基因间的距离的增加而增大。（2）位于同一染色体上的基因在遗传中一般倾向于维系在一起，表现为连锁（linkage）；它们之间的重组是通过一对同源染色体的两个非姊妹染色单体之间的交换来实现的。（3）衡量遗传距离的远近的单位是重组率,3、图谱