中国医科大学研究生选修课-细胞生物学实验技术

,细胞生物学实验技术,cellularlevelSubcellularlevelMolecularlevel,显微技术细胞分离技术细胞培养技术细胞组分的分级分离细胞示踪技术细胞分子生物学技术,一、显微镜技术microscopym微米=10-6mnm纳米=10-9m埃=10-10m(一)光学显微镜技术利用光线照明,将微小物体形成放大影像的仪器,1.显微镜的分辨率显微镜或人眼在25cm的明视距离处,能分辨被检物体微细结构最小间隔的能力。R=光学显微镜的分辨极限0.2m,n:聚光镜和物镜之间介质的折射率.空气为1,油为1.5:标本对物镜镜口张角的半角.sin的最大值为1:照明光源的波长.白光为0.5m,100m,0.2m,2.光镜标本切片的制备(1)固定定义：将组织浸入化学试剂中，通过在细胞中大分子间形成交联，保持细胞中原有结构的形态和位置的过程。固定的目的：A防止组织自溶或腐败B保持细胞原有的形态C保持细胞各种成分的原有位置常用固定剂：乙醇、甲醛、戊二醛,(2)包埋定义：将组织块包入包埋剂使组织硬化的过程。常用的包埋剂：液体石蜡、树脂(3)切片1-10m,（4）染色采用某些化学物质特异性或选择性地与细胞内的某些成分相互作用，从而原位显示细胞某种成分或结构的方法A选择性染色考马斯亮蓝蛋白质Brachet反应,HE染色,B特异性染色酶+底物抗原+抗体,+substrate,antigen,antibody,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,酶标记（酶联免疫吸咐实验ELASA）荧光标记,3.荧光显微镜技术(1)原理荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的短波光线，并发射出比原来吸收波长更长的光,（2）荧光显微镜的基本构造A紫外光光源B二向色镜：反射短波光线，透过长波光线C滤光片,（3）常用的荧光染料荧光素罗丹明FITC,（4）应用A免疫荧光显微技术（Immunofluorescencemicroscopy）抗体+荧光染料,B绿色荧光蛋白GFP,4.相差显微镜（phasecontrastmicroscope）(1)原理波长颜色振幅亮度速度相位,普通显微镜:光通过染色标本时，波长和振幅发生变化，人眼才能观察到。但光通过活细胞时，波长和振幅几乎无改变，这就无法用人眼观察。,相差显微镜：细胞内的各结构可因密度不同而产生相位差(即光程差)，不过人眼无法鉴别这种微小的变化。相差显微镜能够把这种“相位差”变成“振幅差”，即图像的明暗差。,(2)应用活体细胞观察,倒置相差显微镜,载物台的上方：光源长焦距聚光器载物台的下方：物镜应用：直接对培养的细胞进行观察,5.暗视野显微镜（dark-fieldmicroscope）,在日常生活中，室内飞扬的微粒尘土不易被看见，但在暗的房间中若有一束从光线从门缝斜射过来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。,原理:利用特殊装置使照射光斜照到样品上，照射光无法进入物镜，故呈暗视野。只有从样品发出的散射光才能进入物镜被放大,在暗的背景中呈现明亮的像。,分辨率：典型的动物细胞1020m一般的细菌和线粒体0.5m(500nm)普通显微镜0.2m(200nm)暗视野显微镜0.004-0.2m(4-200nm)应用：能观察物体轮廓,分不清内部的微细结构。用以观察活细胞内的细胞核、线粒体,以及液体介质中的细菌等微粒的运动。,6.显微电影摄影,记录细胞或细胞器运动过程和速度,用显微电影摄影术或电视录像以一定间隔拍摄一次细胞状态，当影片或电视录像以正常速度反映时，所拍摄的情节就被大大加快了，用这种方法可以准确地记录细胞或细胞其的运动过程和速度。,7.激光扫描共焦显微镜（LaserScanningConfocalMicroscope）(1)原理在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共轭聚焦装置和检测系统而形成的显微镜。,单色激光光源照明针孔形成点光源分层扫描三维重建,激光作扫描光源扫描焦平面上样品，得样品切面像载物台上微量步进马达使载物台上下移动,改变焦平面得不同层次的切面图像计算机图像三维重组获样品立体图像,显微CT,（2）应用A细胞的三维重建B细胞定量荧光检测DNARNA蛋白质含量C细胞内Ca2+pH动态检测D细胞间通讯,果蝇胚胎原肠胚,（二）电子显微镜技术利用电子与固体样品作用时所发出的信息,对样品进行微区观察和分析的技术亚显微结构超微结构1.电子显微镜的特点高分辨率理论上R=0.002nm实际上R=0.1nm生物标本R=2nm高放大倍率1,000,000,阴极(钨丝),阳极,聚光镜（电磁透镜）,物镜中间镜投影镜,电镜照片,照相底片,真空、上下颠倒,2.透射电子显微镜（Transmissionelectronmicroscope,TEM）(1)基本构造,透射电镜的成像原理,电子束通过标本时，根据标本各部位密度的不同，部分电子发生散射，只有剩余的电子成像，经物镜和投射镜放大后投射到照相底片或荧屏上。由于散射的电子不参加成像，故标本中密度大的部分成像后形成电子流量减少的暗区；相反密度小的部分散射电子少而形成明区。,透射电镜,光学显微镜,(2)超薄切片的制备A固定戊二醛:蛋白质锇酸:脂类,B脱水上升梯度乙醇：30%50%70%80%90%95%100%C包埋环氧树脂D切片500700,E重金属染色U(醋酸双氧铀)Pb(柠檬酸铅),生物分子由原子序数低的轻元素组成，它们散射电子能力弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,需加大生物样品反差,进行染色。,电镜三维重建技术,2.扫描电子显微镜（Scanningelectronmicroscopy,SEM）,(1)原理二次电子(2)分辨率3-10nm,扫描电镜的成像原理阴极钨丝加热后产生的电子束经过栅极和阳极加速和会聚，再经二级聚光镜及物镜会聚形成具有一定能量、一定束流强度和束斑直径的微细电子束；电子束在扫描线圈驱动下，在试样表面按一定时间、空间顺序作栅网式扫描。聚焦电子束与试样相互作用，产生二次电子发射。二次电子发射量随试样表面形貌而变化；二次电子信号被收集、转换、放大，在电视荧光屏上同步扫描成像。,a.样品表面形貌表面越突出，图像越亮表面越凹陷，图像越暗b.样品与集电器的关系面向集电器，图像越亮背向集电器，图像越暗,(3)样品的制备A固定B脱水C干燥临界点干燥D染色离子溅射镀膜AuPt,临界点干燥的原理当温度、压力达到一定的数值时，气体的密度可增大到与液态一样，此时气相与液相的界面消失，液体的表面张力亦会随之消失，这种情况称为临界状态。临界点干燥：利用物质在临界状态下液体表面张力被消除的特性，克服样品干燥过程中的变形，保持样品原状，达到干燥的目的。,扫描电镜的特点,高的分辨率,很强的立体感,放大倍率范围广,针尖细菌,样品适应性大,应用范围广,透射电镜利用穿透标本的电子进行成像(散射)观察组织的二维切片扫描电镜利用标本表面发射的二次电子成像观察组织的表面三维结构,冰冻断裂电镜-观察生物膜结构,A冰冻组织(液氮)B重金属喷镀(Pt)C喷碳加固(C)-SEMD复型-TEM,随样品表面结构的高低起伏，重金属形成不同厚度的薄膜，显示了投影效果，给出了一个样品表面结构的三维图像。,冰冻蚀刻电镜-观察生物膜结构,A冰冻组织(N2)B真空中升华C重金属喷镀(Pt)D喷碳加固(C)-SEME复型-TEM,优点*样品不经固定、脱水、包埋，更接近自然状态*对样品无损伤*研究膜分子结构的唯一显示方法*可获得立体结构图象,P(F)：protoplasmicfractureface内裂面E(F)：extracellularfractureface外裂面PS：protoplasmicsurface内表面ES：extracellularsurface外表面,应用肌营养不良症,1.正常PF面2.DMD的PF面3.正常EF面4.DMD的EF面14骨骼肌细胞冷冻蚀刻样品,负染电镜技术-观察纤维状颗粒状成分,原理：用只沉积于样品周围的、比样品密度高的物质(如磷钨酸)对样品进行染色，使样品和背景形成显著的明暗对比,这种染背景而不染样品的方法叫负染。应用：适用于颗粒或纤维等游离的样品。特别是在病毒性致病因子的超微病理诊断中广泛应用。,磷钨酸染色,1959年，Brenner和Horne用负染法发现了人的腺病毒和脊髓灰质炎病毒。正式命名negativestaining,X射线衍射技术（x-raydiffraction）,应用：测定分子中原子的三维排列的唯一方法原理及方法：*制备结晶*选择波长*获得衍射图*计算和分析,核磁共振技术（NMR）,特点：测定蛋白质的液相空间结构。,二、细胞分离技术（cellseparation）从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法1.制备单一细胞悬液组织单一细胞,消化,EDTA细胞间连接,胰酶细胞外基质,二、细胞分离技术（cellseparation）从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法1.制备单一细胞悬液组织单一细胞,消化,EDTA细胞间连接,胰酶细胞外基质,2.分离不同类型细胞(1)离心（centrifugation）大小密度形状小轻不规则大重圆形,(2)亲和表面,(3)流式细胞仪(flowcytometer)能够快速分选或检测细胞及其组分的物理或化学特性的技术A原理:抗原+抗体*荧光标记B样品制备细胞悬液制备细胞固定细胞染色,B应用*细胞分选cellin10005000cells/sec*细胞大小测量*DNA含量测定*免疫表型分析*细胞功能分析*细胞凋亡研究,细胞周期分析,(4)激光捕获显微切割技术（Lasercapturemicrodissection，LCM）从组织切片中精确分离获取单一细胞的方法,工作原理及过程:A制备组织切片B镜下将组织切片覆以薄膜C激光束切割特定细胞或区域D收集管收集,三、细胞培养技术（Cellculture）从活体组织中分离出特定的细胞，在一定的条件下进行培养，使之能够继续生存、生长以至增殖的方法invitro用培养细胞做实验invivo用动物做实验,1.细胞培养的条件(1)固体表面：培养瓶、培养皿(2)培养基常见培养基：1640DMEM,(3)无菌无菌操作：超净工作台、火焰消毒等培养液中加入抗菌素器械、溶液消毒（烤箱、高压灭菌、过滤）(4)其他温度37湿度100%CO2浓度5%,2.细胞培养的传代原代培养:直接取材于有机体的细胞培养取材切割消化培养传代培养:将原代培养存活的细胞从培养瓶中取出，以1:2以上的比例扩大培养原代培养传代培养,传代,功能：保持原分化特性形态：多不保持原有细胞形态成纤维样细胞上皮样细胞,培养细胞的特点：,3.细胞系（Cellline）原代培养细胞成功传代即为细胞系。来源：（1）在细胞培养中，偶然情况下产生的具有无限繁殖能力，能够无限传代的细胞群。变异细胞细胞系3T3小鼠成纤维细胞,无限繁殖,（）由癌细胞建立的“癌细胞系”特点:可在培养皿中以极高的密度增殖，没有扩展的余地时,可向空间生长。Hela人宫颈癌细胞（）正常细胞经诱导建立的“转化细胞系”肿瘤病毒放射线化学致癌物用癌基因转染正常细胞,4.细胞克隆（Cellcloning）,克隆（clone）：指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。,群体培养（massculture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合(confluence)后形成均匀的单细胞层。克隆培养（clonalculture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每个细胞形成一个细胞集落，称克隆。,5.细胞融合（Cellfusion）（1）定义在自然或人工条件下，使二个或二个以上细胞合并形成一个细胞的过程。,异核体,杂交细胞,分裂,（2）促融方法生物学方法：仙台病毒化学方法：PEG物理方法：电脉冲打孔仪（3）应用A细胞核和细胞质间的相互作用,鸡红细胞组织培养细胞融合红细胞开始合成RNA,并进行DNA复制,B膜蛋白的流动性,C基因定位D单克隆抗体制备B淋巴细胞肿瘤细胞,Mousecell,Humancell,division,E细胞周期相关因子的发现,四、细胞组分的分级分离通过逐级分离对细胞内细胞器和各种成分的化学性质和功能进行研究的方法。匀浆、分级分离、分析（一）离心法用于分离细胞器和大分子,1.破坏细胞,匀浆液,膜细胞器大分子,低渗超声去污剂强制过滤研磨,细胞,破坏,2.分离组分(1)差速离心法分离对象:大小和形状显著不同的组分（细胞核、细胞器）具体方法:由低速到高速逐级沉降(repeat),(2)速度沉降法分离对象:密度相近而大小、形状略有差异的组分(沉降系数S)具体方法:在离心管中予装5%-20%蔗糖梯度的离心介质,(3)平衡沉降法分离对象:密度不同的组分（与大小、形状无关）具体方法：在离心管中予装一定密度梯度的离心介质（20%-70%蔗糖、CsCl）介质最低密度大于被分离组分的最大密度。,（二）层析法（柱层析）主要用于分离、纯化蛋白质,填充柱填料（固定相）流动相,1.离子交换层析层析介质:阴离子或阳离子树脂分离原理:电荷,2.凝胶过滤层析层析介质:凝胶分离原理:分子大小,3.亲和层析层析介质:基质+抗体底物分离原理:亲和性,4.高压液相层析HPLC基质粒度小（3-10m）、分辨率高、分离速度快,(三)电泳法主要用于分离蛋白质、核酸1.琼脂糖凝胶电泳分离对象:核酸支持介质:琼脂糖凝固点40-45不同浓度凝胶具有不同孔径电泳缓冲液:TAETBE染料:溴化乙锭EB,(三)电泳法主要用于分离蛋白质、核酸1.琼脂糖凝胶电泳分离对象:核酸支持介质:琼脂糖凝固点40-45不同浓度凝胶具有不同孔径电泳缓冲液:TAETBE染料:溴化乙锭EB,2.SDS-PAGE分离对象:蛋白质(蛋白质分子量、亚单位组成)样品处理:SDS阴离子表面活性剂-巯基乙醇还原剂大小电荷形状支持介质:丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺染色:考马斯亮蓝银染特异性蛋白(westernblotting),Western印迹技术将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜,然后将膜与特异性抗体作用,膜上特定蛋白条带将与抗体结合,并进一步与酶标记二抗反应,最终以发色底物显色而被检测.基本步骤:(1)SDS-PAGE(2)转膜(3)抗体反应一抗孵育标记二抗孵育(4)显色,3.等点聚焦电泳,4.双向电泳根据蛋白质分子量、等电点分离等电聚焦:等电点SDS:分子量,5.质谱技术通过测定样品离子的质/荷比来进行成分和结构分析的方法。应用：蛋白质鉴定。,2002年诺贝尔化学奖获得者,电喷雾电离electrosprayionization软激光解吸电离softlaserdesorption,五、细胞内分子的示踪技术用一定的方法显示细胞中的分子,并对其在细胞内的代谢过程进行追踪.(一)同位素示踪技术1.原理同位素:核外电子数相同化学性质相同原子核重量不同放射性同位素:衰变,2.应用(1)条件可检测、可摄入(2)方法放射自显影（autoradiography）蛋白质-aaDNA-TRNA-U,脉冲标记,A放射性物质脉冲掺入活细胞B不同时间取样切片C暗处暴光D显影、定影,(3)过程,大肠杆菌DNA结构的证明,(4)应用A细胞内生物大分子的定性、定位与半定量,B示踪细胞中几乎所有的过程,用3H-胸苷、3H-尿苷渗入细胞DNA在细胞核中合成RNA在细胞核中合成并保留在核内很快累积于细胞质中,(二)抗体示踪技术1.单克隆抗体（monoclonalantibody）B淋巴细胞肿瘤细胞,2.抗体+荧光染料LM(免疫荧光显微镜),3.抗体+电子致密物EM（免疫电镜）,电子致密物：胶体金,4.ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay)抗体酶,酶,酶,底物,显色,六、细胞分子生物学技术1.聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）特异性体外DNA扩增技术利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板，以dNTP为原料，在DNA聚合酶作用下进行的DNA体外合成技