细胞生物学-第三章细胞生物学研究方法

第三章细胞生物学研究方法,进行初步观察,形成可验证的假说,设计对照试验,收集资料,解释结果,作出合理结论,查阅已有知识,生物学研究模式生物不同物种享有共同分子机制,思考题,P81：1，2，3，4,第三章细胞生物学研究方法,细胞形态结构的观察方法细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术,第一节细胞形态结构的观察方法,光学显微镜技术（lightmicroscopy）电子显微镜技术(Electromicroscopy)扫描探针显微镜（ScanningProbeMicroscope）扫描遂道显微镜(scanningtunnelingmicroscope),第二节细胞组分的分析方法,离心分离技术细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性放射自显影技术定量细胞化学分析技术,第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术,细胞的培养细胞工程,一、光学显微镜技术（lightmicroscopy),普通复式光学显微镜技术荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）激光共焦扫描显微镜技术（LaserConfocalMicroscopy）相差显微镜（phase-contrastmicroscope）,二、电子显微镜技术,电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造主要电镜制样技术负染色技术冰冻蚀刻技术超薄切片技术电镜三维重构技术扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）SPM(Scanningprobemicroscope),三、扫描遂道显微镜,扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope，STM）原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。（侧分辨率为0.10.2nm，纵分辨率可达0.01nm）；（2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息；（3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。（4）可连续成像，进行动态观察用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。,普通复式光学显微镜技术,光镜样本制作分辨率是指区分开两个质点间的最小距离,荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）,原理与应用直接荧光标记技术间接免疫荧光标记技术在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用,激光共焦扫描显微镜技术（LaserScanningConfocalMicroscopy）,应用：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.41.7)，可重构样品的三维结构。原理,相差显微镜（phase-contrastmicroscope）将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动,电镜与光镜的比较,电镜与光镜光路图比较,电子显微镜的基本构造,主要电镜制样技术,超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图负染色技术（Negativestaining）与金属投影染色背景，衬托出样品的精细结构冰冻蚀刻技术（Freezeetching）（技术示意图）冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。快速冷冻深度蚀刻技术（quickfreezedeepetching）电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。,扫描电镜,原理与应用：电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题,一、离心分离技术,用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离,二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法,原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。FeulgenStaining,三、特异蛋白抗原的定位与定性,免疫荧光技术：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限（图）蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹反应(Western-Blot)免疫电镜技术：免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等,四、细胞内特异核酸的定位与定性,光镜水平的原位杂交技术（同位素标记或荧光素标记的探针）电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）PCR技术,五、放射自显影技术,原理及应用：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。步骤：前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）放射自显影,六定量细胞化学分析技术,细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。包括：紫外光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法流式细胞仪（FlowCytometry）主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。,一、细胞的培养,动物细胞培养类型：原代培养细胞（primaryculturecell）继代培养细胞（sub-culturecell）细胞株（cellstrain）正常二倍体，接触抑制细胞系（cellline）亚二倍体，接触抑制丧失植物细胞类型：原生质体培养（体细胞培养）单倍体细胞培养（花药培养）非细胞体系（cell-freesystem）,二、细胞工程,细胞融合（cellfusion）与细胞杂交（cellhybridization）技术单克隆抗体（monocloneantibody）技术图细胞拆合与显微操作技术物理法结合显微操作技术(图1)化学法结合离心技术制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。其它技术遗传分析（mutant,knockout,knockin）对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈,对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈,细胞生命活动,突变体分析,突变体分析,蛋白修饰分析,基因表达,多肽定性分析,生物信息学,序列测定,双向电泳分析,DNA分离与克隆,机器人技术(robotics),功能基因组学,蛋白质分离与制备,蛋白质组学,AcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)underbright-field;b)phase-contrast;c)DIC,Examplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate钾磷钨酸(a)orshadowcastingwithchromium铬(b).,由Binnig等1981年发明。根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。,在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复23次效果会好一些。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。（速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀）,用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。,福尔根反应自Feulgen等1924年发明该显示DNA的Feulgen反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。具体反应原理：标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子,因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。简言之：DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。,免疫荧光技术是利用荧光素标记的抗体（或抗原）检测组织、细胞或血清中的相应抗原（或抗体）的方法。由于荧光抗体具有安全、灵敏的特点，因此已广泛应用在免疫荧光检测和流式细胞计数领域。根据荧光素标记的方式不同，可分为直标荧光抗体和间标荧光抗体。间标荧光抗体中一抗并不直接连接荧光素，而是先将一抗结合到蛋白，然后带有荧光素的二抗再结合至一抗。通过二抗的结合，能将信号进行放大，因此能在一定程度上提高检测的灵敏度，但是随之带来的高背景也降低了检测的特异性。近年来，随着荧光素和荧光检测技术的不断进步，荧光检测的灵敏度已经接近同位素检测的水平，直接标记的荧光抗体逐渐取代间接标记抗体。,Caenorhabditiselegans,Drosophilamelanogaster,Arabidopsisthaliana,为什么需要模式生物？如果你来选，你选择某物种作为模式生物的依据是什么？,体外培养的BHK-21细胞经选择性抽提后用抗Mr280X103核骨架蛋白抗体进行免疫胶体金标记的结果IF：中间纤维；g：金颗粒；N：核区,Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养,流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒（如细菌）逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。简言之，流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并可分类收集的高技术。FCM以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。,原理：待测样本的细胞悬液，在鞘液的包围和约束下，细胞排成单列高速由流动室喷嘴喷出，形成细胞液柱。当液柱通过检测区，在入射的激光束照射下产生前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），它们分别反映细胞大小和颗粒度，根据这些特性可以将细胞分类。经一种或几种特殊荧光标记的样本，在激光束的激发下所产生的特定荧光，可被光学系统检测并输送到计算机进行分析，得到细胞相应的各种特性。,免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位技术。该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。免疫电镜的应用，使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。,激光共聚焦扫描显微镜（laserconfocalscanningmic