第三章--细胞生物学研究方法

第三章细胞生物学研究方法,细胞生物学研究方法,进行初步观察,形成可验证的假说,设计试验,收集资料,解释结果,作出合理结论,查阅已有知识,生物学研究模式生物不同物种享有共同分子机制,如何学习细胞生物学？,抽象思维与动态观点结构与功能统一的观点同一性(unity)和多样性(diversity)的问题细胞生物学的主要内容：结构与功能（动态特征）；细胞的生命活动；实验科学与实验技术细胞真知源于实验室Whatweknow/Howweknow.,第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术第四节用于细胞生物学研究的模式生物,第一节细胞形态结构的观察方法(注意分辨率的差异*),1光学显微镜技术（lightmicroscopy）2电子显微镜技术(Electronmicroscopy)3扫描遂道显微镜(scanningtunnelingmicroscope),一、光学显微镜技术（lightmicroscopy)(目前为止最广泛应用的显微技术),普通复式光学显微镜技术荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）激光共焦扫描显微镜技术（LaserConfocalMicroscopy）相差显微镜（phase-contrastmicroscope）,普通复式光学显微镜技术,三部分组成：光学放大系统、照明系统和机械和支架系统分辨率*是指区分开两个质点间的最小距离,光镜样本制作,荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）,原理与应用(两套滤光片，主要用于特异蛋白质定性定位)直接荧光标记技术间接免疫荧光标记技术在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用,激光共焦扫描显微镜技术（LaserScanningConfocalMicroscopy）,原理应用：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.41.7倍)，通过“光切片”观察样品内部结构，可重构样品的三维结构。,相差显微镜（phase-contrastmicroscope）将光程差或相位差转换成振幅差，将样品中的密度差异表现为明暗区别。可用于观察活细胞。微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器。录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动。,二、电子显微镜技术,电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造电镜的类型（透射电镜、扫描电镜）主要电镜制样技术负染色技术冰冻蚀刻技术超薄切片技术电镜三维重构技术扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）,电镜与光镜的比较,电镜与光镜光路图比较,电子显微镜的基本构造,电子束照明系统、成像系统、真空系统、记录系统,主要电镜制样技术,超薄切片技术用于电镜观察的样本制备(40-50nm)示意图细胞超微结构（常用试剂）负染色技术（Negativestaining）与金属投影染色背景，衬托出样品的精细结构，如病毒、核糖体等结构。冷冻蚀刻技术（Freezeetching）（技术示意图）冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。快速冷冻深度蚀刻技术（quickfreezedeepetching）电镜三维重构技术电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。,扫描电镜,原理与应用：电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题,三、扫描遂道显微镜,ScanningProbeMicroscope,SPM80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器，包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等。反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。分辨率：侧分辨率：0.10.2nm，纵分辨率：0.001nm用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构，观察生物大分子、膜、病毒等的结构。,第二节细胞组分的分析方法,1离心分离技术2细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法3特异蛋白抗原的定位与定性4细胞内特异核酸的定位与定性5放射自显影技术6定量细胞化学分析技术学习过程中，注重基本概念的掌握。,一、离心分离技术,用途：用于分离细胞器与生物大分子及其复合物差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离,二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法,原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。*FeulgenStaining（DNA）；苏丹染色（脂类）；Millon染色（蛋白）等。,三、特异蛋白抗原的定位与定性,免疫荧光技术免疫学与荧光标记的方法结合起来，快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限（图）免疫电镜技术：免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术应用：能对蛋白进行精细定位。如通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹反应(Western-Blot),四、细胞内特异核酸的定位与定性,原位杂交光镜水平的原位杂交技术（同位素标记或荧光素标记的探针）电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）,目前为止最清晰的病毒蛋白和DNA显微照相,五、放射自显影技术,概念、原理及应用：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；常用同位素及其选择的规律。实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。步骤：同位素标记的生物大分子前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）细胞内同位素所在位置的显示放射自显影（细胞、蛋白）,六定量细胞化学分析技术,细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。包括：紫外光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法流式细胞仪（FlowCytometry）主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。,第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术,1细胞的培养2细胞工程注意基本概念的掌握*,一、细胞的培养,动物细胞培养（形态发生改变，成纤维样、上皮样细胞，还有少量游走细胞）类型：原代培养细胞（primaryculturecell）传代培养细胞（sub-culturecell）细胞培养过程基本相同（离体、消化、悬浮、贴壁）。有限细胞系（cellstrain）正常二倍体，具有接触抑制。连续细胞系（cellline）染色体改变，接触抑制丧失，无限传代。细胞克隆、细胞株：具有遗传标记的细胞系。植物细胞培养类型：体细胞培养单倍体细胞培养（花药培养）原生质体培养（体细胞培养）,转基因植物细胞的培养与分化是植物基因工程的基础。非细胞体系（cell-freesystem）,二、细胞工程,细胞融合（cellfusion）与细胞杂交（cellhybridization）技术（常用方法相似，会有染色体丢失现象）单克隆抗体技术细胞拆合（核质分离，物理和化学两种方法）与显微镜操作技术转基因动物与转基因植物,对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈,细胞生命活动,突变体分析,突变体分析,蛋白修饰分析,基因表达,多肽定性分析,生物信息学,序列测定,双向电泳分析,DNA分离与克隆,机器人技术(robotics),功能基因组学,蛋白质分离与制备,蛋白质组学,样品一般经固定、染色后观察。较厚样品切片后观察。,AcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)underbright-field;b)phase-contrast;c)DIC,Examplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).,固定包埋切片染色,密度梯度离心：连续密度梯度不连续密度梯度常用的介质：蔗糖、氯化铯、甘油等。,Caenorhabditiselegans,Drosophilamelanogaster,Arabidopsisthaliana,Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养,细胞融合：两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象。同核细胞融合异核细胞融合,1.Fluorescence,FluorescentMicroscope,Objective,ArcLamp(弧光灯),EmissionFilter,ExcitationDiaphragm(光圈),Ocular(目镜),ExcitationFilter,FluorescenceMicroscopeimageofHoechststainedcells(plusDIC)Imagecollectedwitha470TOptronicscooledcamera,FluorescentMicroscope,Objective,ArcLamp,EmissionFilter,ExcitationDiaphragm,Ocular,ExcitationFilter,Objective,Laser,EmissionPinhole,ExcitationPinhole,PMT,EmissionFilter,ExcitationFilter,ConfocalMicroscope,ConfocalSystem,Fluorescentimageofpaper,PineTreepollen-collectedonaBio-RadMRC1024atPurdueUn