脐血造血干细胞短时间冻存效果验证

脐血造血干细胞短时间冻存效果验证 摘要 为了验证脐血造血干细胞短时间冻存的有效性，使用羟乙基淀粉沉降去除脐血中的红细胞，淋巴细胞分离液获取脐血单个核细胞，流式细胞仪测定CD34+细胞纯度，从而获得将含有HSC的脐血单个核细胞用冻存液悬起，并将单个核细胞以2107个ml的冻存密度冻存在2ml冻存管中，立即放入装有异丙醇的程序降温盒中，并将冻存盒放入-80冰箱中进行程序降温，五小时后转入液氮冻存。分别在冻存1个月、2个月、3个月进行复苏，并做台盼蓝活率检测、流式细胞仪测定CD34+细胞纯度。结果: 三个月内细胞复苏率和台盼蓝活率检测没有显著变化，液氮可以有效地短时间冻存脐血造血干细胞。关键词：脐血；造血干细胞；冻存；复苏Umbilical cord blood hematopoietic stem cells cryopreserved short time effect validationAbstractIn order to verify the effectiveness of cryopreserved cord blood hematopoietic stem cells for short periods of time, remove the red blood cells in the umbilical cord blood, using hydroxyethyl starch subsidence Methods: hydroxyethyl starch subsidence, remove the red blood cells in the umbilical cord blood lymphocyte separation medium for umbilical cord blood mononuclear cells, flow cytometry instrument determination of purity of CD34 + cells. To using umbilical cord blood mononuclear cells of freeze-stored liquid suspension, and mononuclear cells to 2 x 107 / ml of frozen storage density frozen tube in 2 ml of cryopreserved, immediately into the program with isopropyl alcohol and cooling box, and the frozen deposit box in the - 80 programs to cool in the refrigerator, after five hours into liquid nitrogen frozen storage. In cryopreserved 1 month, 2 months, 3 months for recovery, and trypan blue live rate detection, flow cytometry instrument determination of purity of CD34 + cells. Results: Three months cell recovery rate did not change significantly and trypan blue live rate detection, liquid nitrogen cryopreserved cord blood hematopoietic stem cells can be effectively for short periods of time. Key words: umbilical cord blood; Hematopoietic stem cell; Frozen storage; recovery 前言脐带血及脐血单个核细胞（cord blood mononuclear cells,CB-MNC ）：脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，通常是废弃不用的。近十几年的研究发现，脐带血中含有大量的脐血单个核细胞，脐带血MNC中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。因此，脐带血MNC已成为造血干细胞的重要来源，特别是无血缘关系造血干细胞的来源。也是一种非常重要的人类生物资源。脐血造血干细胞(Cord blood hematopoietic stem cells,CB-HSC)：CD34是最常用的分离造血干细胞的标志。CD34+干细胞主要存在于骨髓和脐带血中，因其具有自我更新、多种分化能力和广阔的应用前景而备受关注1脐血移植(cord blood transplantation，CBT)近年来在国内外得到迅速发展，临床实践表明CBT是治疗白血病、恶性淋巴瘤及重型海洋性贫血等多种疾病的有效方法2。由于脐血来源充足，采集方便，对母亲及胎儿无危害，HLA配型要求不高，脐血中含有丰富的造血干细胞及免疫活性细胞，脐血已经成为骨髓造血干细胞的重要补充，尤其在儿童恶性血液病的治疗中，脐血移植大有取代骨髓移植之势。同时，脐血移植也暴露出一些严重问题，如单份脐血中造血干细胞的数量有限，植入率偏低，平均约72，移植后造血及免疫功能恢复缓慢，由此造成的早期移植相关死亡率偏高3，平均约20。如何有效利用数量有限的造血干细胞，脐血的冷冻保存技术一直备受关注。本文通过单个核细胞计数、台盼蓝拒染率及CD34+细胞计数等指标，探讨短时间冻存脐血造血干细胞有效性，为脐血造血干细胞深低温长时间冻存和脐血移植的临床应用提供参考。冻存过程中影响脐血干细胞复苏后各种性能的因素很多，比如：冷冻速率、冻存时间、冷冻保护剂的选择、以及复苏的程序等等4。程控降温是脐带血造血干细胞冷冻最常采用的方法。本实验操作按常规程控降温系统冻存脐血造血干细胞，立即将装有脐血造血干细胞的冻存管放到装有异丙醇的程序降温盒中，使冻存管细胞悬液温度下降速率保持1/min，是较为理想的降温过程5。冻存液（4冰箱中保存）组成：90%自身脐血血清+10%DMSO 6一、研究方法1、实验材料1.1、主要仪器：倒置显微镜(Olympus)、流式细胞仪(EliteESP美国Beckman Immunotech公司产品)、低速台式离心机（北京北利DT5-2）、-80超低温冰箱（日本三洋）、液氮、电子分析天平1.2、主要试剂：PE-CD34单抗（美国BD公司）、淋巴细胞分离液(天津灏洋)、羟乙基淀粉（贺斯，北京费森尤斯卡比）、生理盐水、台盼蓝、DMSO(sigma)1.3、主要试剂的配制：1.3.1、4%台盼蓝母液：用电子分析天平称取4g台盼蓝，加少量三蒸水研磨，并用三蒸水配制成100ml，滤纸过滤，4度保存。使用时，用PBS稀释至0.4%。染色终浓度为0.04%71.3.2、冻存液（4冰箱中保存）配制：90%自身脐血血清+10%DMSO 2、实验方法2.1、脐血采集9份脐血标本均来自医院妇产科出生的胎儿。要求产妇年龄35岁，妊娠3442周，营养、发育正常，无恶性肿瘤及各种遗传性疾病，无乙肝、丙肝、梅毒等急慢性传染病，妊娠期内无严重合并症。胎儿娩出断脐后，即从脐静脉穿刺抽取脐血注入含有肝素抗凝剂三联袋中备检。2.2、羟乙基淀粉（HES）沉降法去除脐血中的红细胞。6%HES按1：4与含有肝素抗凝剂的脐血混合8，静置40min，取上清液。2.3、脐血单个核细胞分离：采用淋巴细胞分离液（Ficoll）分离脐血中的单个核细胞(MNC)。在50 mL离心管中加入25 mL Ficol1分离液，缓慢加入等量的去除红细胞的脐血上清液，2000r/min 20离心20min，吸取白细胞层，用50ml生理盐水悬起细胞，混匀，取2ml细胞悬液于EP管中用于细胞计数、台盼蓝活率检测和CD34+细胞纯度测定。2000rmin离心20min，离心后弃掉上清。2.4、90%自身脐血血清+10%DMSO 作为细胞冷冻保护剂。用冷冻保护剂重悬细胞，调整细胞密度为2107个ml，装入2ml冻存管中，立即放入装有异丙醇的程序降温盒中，并将冻存盒放入-80冰箱中进行程序降温，五小时后转入液氮冻存。分别冻存1、2及3个月后，每次取出3份标本（第一个月取编号13、第二个月取编号46、第三个月取编号79）放入37水浴箱中快速复苏9。2.5、检测指标用台盼蓝拒染法显微镜下计算单个核细胞活率，用流式细胞仪检测CD34+细胞纯度。CD34单抗购自美国BD公司，为小鼠IgG型抗人抗体。每个样本用FITC标记同型IgG作为阴性对照，直接免疫荧光标记法标记细胞表面抗原，按前散射侧散射圈定淋巴细胞群，以流式细胞仪配套软件(Elite 45版本)分析样本中10106个细胞的标记阳性表达率。3、数据处理和分析3.1、统计学处理检测结果以均数标准差(xS)表示，各组间先采用F检验比较，然后采用t检验。 P005认为两总体差异有统计学意义，即两总体存在显著性差异。4、结果9份脐带血的平均采集量为(92421688)mL，平均MNC为(2.190.44)108 ，流式细胞仪测定CD34+细胞平均纯度为（2.580.25）%。经在-196液氮冻存1、2、3个月后，取出标本放入37水浴箱中快速复苏。三个月脐血单个核细胞复苏率、CD34+细胞（HSC）复苏率及台盼蓝活细胞率进行对比，均无显著差异。二、结果分析与讨论 表1：MNC冻存前后细胞计数（n108） 冻存一个月 冻存两个月 冻存三个月MNC冻存前细胞计数 2.31+0.20 2.16+0.72 2.11+0.43MNC冻存后细胞计数 1.77+0.25 1.68+0.70 1.54+0.40 表2：MNC复苏率 编号13 编号46 编号79MNC复苏率 0.81、0.76、0.72 0.83、0.75、0.71 0.77、0.72、0.69MNC冻存一个月进行复苏，细胞平均复苏率为：76.6%；MNC冻存两个月进行复苏，细胞平均复苏率为：77.8 %；MNC冻存三个月进行复苏，细胞平均复苏率为：73.0 % ；MNC冻存一个月后复苏结果和冻存两个月后复苏结果不存在显著差异（F=1.84 F表 T=0 F0.05）；MNC冻存两个月后复苏结果和冻存三个月后复苏结果不存在显著差异（F=2.28F表 T=1.049 F0.05）；MNC冻存一个月后复苏结果和冻存三个月后复苏结果不存在显著差异（F=1.24F表 T=1.049 F0.05）。说明短时间冻存不会影响冻存后复苏结果。由于细胞挂壁率较高，导致冻存后复苏率较小，所以适当调节冻存密度有助于提高冻存后细胞复苏率。（表1、表2） 表3：HSC冻存前细胞计数（n106） 冻存一个月 冻存两个月 冻存三个月HSC冻存前细胞计数 6.30+0.80 5.54+2.71 5.28+1.69HSC冻存后细胞计数 4.20+0.87 3.74+2.01 3.37+1.31HSC冻存一个月进行复苏，冻存前细胞计数为：6.30+0.80，冻存后细胞计数为：4.20+0.87，细胞平均复苏率为：66.7%；HSC冻存两个月进行复苏，冻存前细胞计数为：5.54+2.71，冻存后细胞计数为：3.74+2.01 ，细胞平均复苏率为：67.5%；HSC冻存三个月进行复苏，冻存前细胞计数为：5.28+1.69，冻存后细胞计数为：3.37+1.31，细胞平均复苏率为：63.8% HSC复苏率与文献6上数据无显著差异。HSC冻存一个月后复苏结果和冻存两个月后复苏结果不存在显著差异（F=1.84 F表 T=0 F0.05）；HSC冻存两个月后复苏结果和冻存三个月后复苏结果不存在显著差异（F=2.28F表 T=1.049 F0.05）；HSC冻存一个月后复苏结果和冻存三个月后复苏结果不存在显著差异（F=1.24F表 T=1.049 F0.05）。说明HSC于液氮中短时间冻存不会影响冻存后复苏结果。（注：HSC细胞数=MNC细胞数CD34+纯度MNC细胞活率）（表3） 表4：台盼蓝细胞活率检测 冻存一个月 冻存两个月 冻存三个月MNC冻存前台盼蓝细胞活率 99.7% 98.5% 98.7% MNC冻存后台盼蓝细胞活率 86.4% 85.8% 85.6%MNC冻存后与冻存前细胞活率有所下降，分析主要原因有两点：（1）、细胞超低温保存，使部分细胞内部水分凝固形成较大的冰晶，而直接导致细胞破碎、裂解，使得细胞的复苏率和细胞活率显著降低。（2）、冻存液中的DMSO对细胞有一定的毒性，有实验表明 ,1 %以上浓度的 DMSO 对细胞有毒性。Rubinstein 等10，影响细胞活率。随着冻存时间的推移，细胞活率一直在下降，但是下降不明显，三个月内活率检测不存在显著差异。三、结论冻存复苏后HSC复苏率分别为66.7%、67.5%、63.8% 三个月内细胞复苏率和台盼蓝活率检测没有明显变化，液氮可以有效地短时间冻存脐血造血干细胞。参考文献：1姚志娟，乌仁娜，毕东杰，等.脐血CD34+细胞体外定向诱导分化为T淋巴细胞的实验研究J.中国免疫学杂志，2003，19(12)：841-844.2任汉云。脐血移植临床评价和主要问题探讨。中华血液学杂志2006；27（11）：791-7923邓雪蓉，任汉云等。100例异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病的发生及其对患者复发和生存的影响。中国实验血液学杂志2009；17：994-9984 Harris D T，Schumacher M J，Ryehlik S et Colection，separationand cryopreservation ofumbilical eord bloodfor use intransplantationBoneMarrow Transplant，1994，13：135 1435 沈华萍等：不同降温速率对脐血干细胞冷冻复苏后生物学特性的影响。生物工程学报2003年7月19卷4