细胞培养基本知识PPT课件

.,1,细胞培养基本知识,.,2,根据中华人民共和国传染病防治法实施办法规定：凡从事致病性微生物实验的科研、教学和生产单位，作为各类传染病菌（毒）研究操作的基本单元，实验室必须有防止致病性微生物扩散的制度和人体防护措施。不同危害群的微生物必须在不同的物理性防护的条件下进行操作，一方面防止实验人员和其他物品受到污染，同时也防止其释放到环境中。,.,3,传染病原危害等级。第一级危害群微生物：与人类成人健康和疾病无关；（无或极低的个体和群体危险）不太可能引起人或动物致病的微生物第二级危害群微生物：在人类所引起的疾病很少是严重的，而且通常有预防及治疗的方法；（个体危险中等，群体危险低）实验室暴露也许会引起严重感染，但对感染有有效的预防和治疗措施，并且疾病传播的危险有限。第三级危害群微生物：在人类可以引起严重或致死的疾病，可能有预防和治疗的方法；第四级危害群微生物：在人类可以引起严重或致死的疾病，通常无预防和治疗的方法，如炭疽杆菌、霍乱弧菌、埃博拉病毒、天花病毒等。,.,4,隔离的设备、实验室的设计及实验实施等3个方面所组成.根据其密封程度的不同，分为P1、P2、P3和P4四个生物安全等级。P是英文protect（保护）的缩写。四级生物安全（P4）是生物安全实验室等级最高的实验室，可以有效阻止传染性病原释放到环境中，同时给研究人员提供生物安全的保证。实验室可分：基础实验室一级生物安全水平、基础实验室二级生物安全水平、防护实验室三级生物安全水平最高防护实验室四级生物安全水平。根据操作不同危险度，等级微生物所需的实验室设计特点、建筑构造、防护设施、仪器、操作以及操作程序来决定实验室的生物安全水平。有关的手册有叙述：与不同危险度等级相对应的（而非“等同的”）各危险度等级微生物所要求的实验室生物安全水平。,生物安全实验室（P1、P2、P3、P4）,.,5,1级基础实验室一级生物安全水平基础的教学、研究,GMT不需要；开放实验台,2级基础实验室二级生物安全水平初级卫生服务；诊断、研究GMT加防护服、生物危害标志开放实验台，此外需BSC用于防护可能生成的气溶胶,.,6,3级防护实验室三级生物安全水平特殊的诊断、研究，在二级生物安全防护水平上增加特殊防护服、进入制度、定向气流BSC和或其他所有实验室工作所需要的基本设备,4级最高防护实验室四级生物安全水平危险病原体研究在三级生物安全防护水平上增加气锁入口、出口淋浴、污染物品的特殊处理级BSC或级BSC。穿着正压服、双开门高压灭菌器（穿过墙体）、经过滤的空气。BSC：生物安全柜；GMT：微生物学操作技术规范,.,7,我国在生物安全方面也制定过一些相应的条例和法规。中华人民共和国卫生行业标准（WS2332002）微生物生物医学实验室生物安全通用准则中对生物安全三级（P3）实验室进行了规定。每个实验室都应该采用“安全手册”或“操作手册”，其中定义了已知的和潜在的危害，并规定了特殊的操作程序来避免或尽量减小这种危害。规范的微生物学操作技术是实验室安全的基础，而专门的实验设备仅仅是一种补充，绝不能替代正确的操作规范。,.,8,在一级生物安全水平操作的微生物不太可能引起人类疾病或兽医学意义的动物疾病。但理想的做法是，所有实验室工作人员应进行上岗前的体检，并记录其病史。疾病和实验室意外事故应迅速报告，所有工作人员都应意识到应用规范的实验室操作技术的重要性。在二级生物安全水平操作微生物的实验室工作人员1、必须有录用前或上岗前的体检。记录个人病史，并进行一次有目的的职业健康评估。2、实验室管理人员要保存工作人员的疾病和缺勤记录。3、育龄期妇女应知道某些微生物（如风疹病毒）的职业暴露对未出生孩子的危害。,.,9,培训,人为的失误和不规范的操作会影响所采取的安全措施对实验室人员的防护效果。因此，熟悉如何识别与控制实验室危害的、有安全意识的工作人员，是预防实验室感染、差错和事故的关键。管理者应确保将安全的实验室操作及程序融合到工作人员的基本培训中。所有实验室工作人员都会经常遇到的高危操作，包括：1、吸入危险（气溶胶产物），如使用接种环、划线接种琼脂平板、移液、制作涂片、打开培养物、采集血液血清标本、离心等2、食入危险，如处理标本、涂片以及培养物3、在使用注射器和针头时刺伤皮肤的危险4、处理动物时被咬伤、抓伤5、处理血液以及其他有潜在病理学危害的材料6、感染性材料的清除污染和处理。,.,10,典型的二级生物安全水平实验室门保持关闭并贴上适当的危险标志。潜在被污染的废弃物同普通废弃物隔开。基本生物安全设备1、移液辅助器避免用口吸的方式移液2、生物安全柜，在以下情况使用：处理感染性物质；如果使用密封的安全离心杯，并在生物安全柜内装样、取样，则这类材料可在开放实验室离心空气传播感染的危险增大时进行极有可能产生气溶胶的操作时（包括离心、研磨、混匀、剧烈摇动、超声破碎、打开内部压力和周围环境压力不同的盛放有感染性物质的容器、动物鼻腔接种以及从动物或卵胚采集感染性组织）。3、一次性塑料接种环，也可在生物安全柜内使用电加热接种环，以减少生成气溶胶。4、螺口盖试管及瓶子。5、用于清除感染性材料污染的高压灭菌器或其他适当工具。6、一次性巴斯德塑料移液管，尽量避免使用玻璃制品。7、在投入使用前，像高压灭菌器和生物安全柜等设备必须用正确方法进行验收。应参照生产商的说明书定期检测。,.,11,废弃物处理,首要原则：所有感染性材料必须在实验室内清除污染、高压灭菌或焚烧。用以处理潜在感染性微生物或动物组织的所有的实验室物品，在被丢弃前应考虑的主要问题有：1、是否已采取规定程序对这些物品进行了有效的清除污染或消毒？2、丢弃已清除污染的物品时，是否会对直接参与丢弃的人员，或在设施外可能接触到丢弃物的人员造成任何潜在的生物学或其他方面的危害？3.清除污染高压蒸汽灭菌是清除污染时的首选方法。需要清除污染并丢弃的物品应装在容器中。任何高压灭菌后重复使用的污染（有潜在感染性）材料不应事先清洗，任何必要的清洗、修复必须在高压灭菌或消毒后进行。也可采用其他除去或杀灭微生物的替代方法4.污染性材料和废弃物的处理和丢弃程序要对感染性物质及其包装物进行鉴别并分别进行处理，相关工作要遵守国家和国际规定。,.,12,合适的环境和必需的条件,1,营养需要,2,环境要求,3,无毒及无污染,.,13,无毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与细胞直接或间接接触的东西都必须是无毒的。,无污染,微生物的污染,不同细胞类型的交叉污染,细菌,霉菌,支原体等,.,14,实验准备,实验用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管,日本三洋CO2培养箱,倒置像差生物显微镜,超净工作台,.,16,自动双重纯水蒸馏器纯水仪,.,17,滤器,.,18,酶标仪微孔板震荡器,.,19,培养板及瓶,.,20,清洗,在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长微生物产品附带杂物上次细胞残留物非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗,.,21,玻璃器皿的清洗,包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、流水冲洗、60烘干、酸泡（24小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、60烘干清洗后的玻璃器皿干净透明无油迹不能残留任何物质,.,22,浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等先用自来水简单刷洗，然后用5稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上,.,23,刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度,.,24,浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时清洁液常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）强清洁液631000200次强清洗液1202001000弱清洁液1001001000配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色,.,25,冲洗在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹最好用洗涤装置如用手工操作需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5次，晾干备用,.,26,胶塞的清洗,新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理常规清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用,.,27,塑料制品的清洗,塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品必要时用2%NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用本实验：自来水洗、蒸馏水洗、蒸馏水煮、甩干水、干燥、装盒；消毒。,.,28,消毒,细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染常见原因：操作间或周围空间的不洁培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染,.,29,消毒灭菌方法,物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min湿热（高压蒸气灭菌法）：121，20min干烤：160,2小时过滤：0.22m化学消毒灭菌法70%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理1新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒抗生素主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染,.,30,细胞培养基应用选择,选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：(1）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。(2)其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。(3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选RPMI1640。(4)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys5A、M199、F10等,.,31,制备1000mlRPMI1640培养基,RPMI1640干粉培养基10.4g（1包）蒸馏水400ml磁力搅拌至完全溶解加三蒸馏水定容至1000ml在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22m孔径滤膜的过滤器除菌，并分装成200ml/瓶，-20保存备用。用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。再加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml。-细胞培养液,.,32,胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,.,33,称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，-20保存备用（以免分解失效），常用浓度为0.25%（0.1%-0.5%）胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调pH至7.2左右,胰蛋白酶溶液配制,.,34,D-Hanks平衡盐溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS),.,35,血清,热灭活：56,30分钟加热已完全解冻的血清热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。血清中的沉淀物絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm,5分钟去除，也可不用处理显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清,.,36,血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56，30分钟血清的消毒：过滤除菌,.,37,EDTA4Na溶液,一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长EDTA溶液配制：用D-Hanks平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4冰箱保存,.,38,消化液,分离组织和分散细胞常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液单独或混合使用,.,39,pH调整液,NaHCO3溶液常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4保存HEPES（分子量238.31）溶液一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升