质粒DNA的提取及电泳检测

实验 质粒DNA的提取及电泳检测一 实验目的 通过本实验学习掌握碱裂解法提取细菌质粒DNA。二 实验原理 1. 细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。 2. 质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法，煮沸法，去污剂（如Triton和SDS）裂解法。3. 碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。三 实验材料：转化后的细菌(含有质粒的大肠杆菌)四、实验用具和药品1. 实验用具:摇床，离心机，移液器及枪头，玻璃试管（15mL）及塞子，离心管（1.5mL）2. 实验试剂：（1）溶液I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）TrisHCl（pH8.0） 10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）（2）溶液II 0.4mol/L NaOH，2%SDS，用前等体积混合（3）溶液III 5 mol/L 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml（4）TE 缓冲液 10 mmol/L TrisHCl（pH8.0） 1 mmol/L EDTA（pH8.0）（5）70%乙醇（放-20冰箱中，用后即放回）（6）加样缓冲液（6X）：40%蔗糖、0.25%溴酚兰（7）电泳缓冲液：0.045mol/L Tris-硼酸 0.001mol/L EDTA （0.5X TBE buffer）电泳缓冲液贮存液：5X：54g Tris碱、27.5g硼酸、20ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）五 实验步骤（一）细菌繁殖挑取白色的单菌落若干，转移到3mL液体LB培养基(附加100mg/ml Amp ),37过夜振荡（200r/min）培养。（二）菌体收集将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，离心30sec 5000r/min；弃上清提取质粒（三）质粒提取方法一：碱裂解法提取质粒DNA1.将上述沉淀重悬于250L冰预冷的溶液中，剧烈震荡；2加入250L溶液，盖紧管口，快速颠倒离心管510次；3加入350L冰预冷的溶液，盖紧管口，温和地颠倒离心管510次；9000r/min离心5min上清转移到另一新1.5mL离心管中；4加等体积氯仿，振荡混合，静置， 9000r/min离心5min，上清转移到另一新1.5mL离心管中；5加入1/10体积3mol/L的醋酸钠和2倍体积的乙醇，充分混匀，静置5min；9000r/min离心5min；6弃上清，用70ethanol洗涤；7加30LTE溶解，-20 保存。方法二：试剂盒提取方法1.离心收集的菌体中加入含RNAase的溶液250L，重悬菌体，不应留有小的菌块；2. 加溶液250L，轻轻颠倒离心管4-6 次，使菌体充分裂解，至溶液澄清；3. 加入350L冰预冷的溶液，温和并充分地上下翻转混合6-8 次；4. 12000r/min离心10min；5. 将上清转移到DNA结合管（置于2 ml 离心管中），12000r/min离心1min，弃滤液；6. 将制备管置回离心管，加入去蛋白试剂500L，12000r/min离心1min，弃滤液；7. 将制备管置回离心管，加洗涤液700L，12000r/min离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700L洗涤液洗涤一次，弃滤液。8. 将制备管置回2 ml 离心管中，12,000g 离心1 min，去除残余的洗涤液；10 将DNA结合柱放入另一个新的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加60-80L洗脱液或去离子水，室温静置1 min。12,000g 离心1 min。（四）检测提取DNA质量的电泳检测。l 取4ul质粒DNA+2ul加样缓冲液+6ul ddH2O；l 配制1%的琼脂糖凝胶l 电泳30min，EB染色，拍照。注意事项：氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌