Northern杂交试验指导手册

Northern杂交试验指导手册 Northern杂交试验指导手册DIG标记的Northern杂交试验指导一、 RNA提取方法一、改良异硫氰酸胍提取法试剂及其配制异硫氰酸胍变性液：贮存液在含484ml 水（经DEPC处理）, 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至6065并持续搅拌使之充分溶解。贮存液室温保存备用（不超过3个月）。工作液在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。工作液于室温下保存不超过1个月。工作液各成分的终浓度为：4mol/L异硫氰酸胍25mol/L柠檬酸钠pH 7.00.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)0.1mol/L巯基乙醇(2-ME)其它溶液：2mol/L乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0)水饱和酚（pH 3.5）491 (v/v) 氯仿/异戊醇100%异丙醇70%乙醇（用DEPC处理水配制）DEPC处理后高压灭菌水试验程序1取0.51g左右新鲜植物组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。2将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，并向其中加入5ml异硫氰酸胍变性液，轻轻摇动离心管使混合均匀。3顺序加入2mol/l NaAc 0.5ml、水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇1ml，每加入一种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15min.。44条件下15000g离心30min.，将上层水相转移至另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀后置于20冰箱冷冻1h.。54条件下13000g离心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml异硫酸胍变型液中（体积为第一次变性液的1/3），再加入等体积的异丙醇，混匀后置于20冰箱冷冻1h.。64条件下13000g离心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于适量体积（50g/100l）的DEPC处理水中，检测后分装，置于70低温条件下保存。注意事项RNA提取过程中，为了保证所提取的RNA的纯度和完整性，其中有两个方面的问题需要特别控制，一是去除与RNA结合的蛋白质，二避免内外源Rnase对RNA的降解。在RNA的提取中，常采用的蛋白质变性剂有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸钠（SDS）等。为防止外源Rnase的污染，所有试验用品均需用DEPC处理并高压灭菌，所有试剂配制均需使用经DEPC处理过的水或灭菌处理。内源RNase的抑制采用异硫氰酸胍等强还原剂。为避免人体污染，所有试验操作均应带手套，避免人体接触所有用品。方法二、改良Krapp提取法试剂及其配制RNA抽提掖：母液：4mol 异硫氰酸胍20mmol EDTA20mmol MESpH 7.0工作液：取400ml母液加入1.7ml 2-ME贮存在4条件下备用。RNA重悬液：2mol LiCl10mmol NaAc调整终体积为250ml，pH 5.2，灭菌后贮存在4条件下备用。试验程序1 取新鲜植物材料0.51g，冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入 10ml RNA抽提掖充分混匀。24条件下8000rpm离心10min.，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4条件下8000rpm离心10min.。3上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混匀后，在4条件下8000rpm离心10min.）。4小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10 vol 3mol NaAc和2 vol冷无水乙醇，在-80条件下沉淀2小时。5在4条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4条件下1小时。64条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装，置于-70条件下保存。二、RNA质量检测提取的RNA需要对其质量和数量进行检测。实验室常用的方法有紫外吸收值检测和电泳检测两种。方法一、紫外吸收检测试剂：TE ( 10mmol/L Tris, 1mmol/LEDTA)。dH2O试验程序1预热紫外分光光度计1020min.。2取两个1ml的狭缝石英杯，一个装入1mlTE溶液作为空白校正液，用来校正分光度计零点及调整透光度至100。3取4l RNA待测样品加入另一比色杯中，加dH2O至1ml，用无菌石蜡膜堵住杯口，倒转混匀。4将两个比色杯置于分光光度计中，调入射光波长，用空白溶液分别调整T至100、OD至0，然后测定样品在260nm、280nm、230nm的OD值。RNA浓度和纯度分析浓度计算：对于单链RNA，OD2601.0时，RNA浓度为40g/ml，按照上述稀释方式，即OD2600.1时，其RNA浓度为1g/ml。纯度分析：纯净的RNA样品其OD260/OD280的比值应介于1.72.0，小于此比值说明有蛋白或苯酚污染，如果比值大于2.0则可能被异硫氰酸胍污染；OD260/OD230比值应大于2.0，如果小于此比值说明有小分子及盐类污染。方法二、变性琼脂糖凝胶电泳检测试剂及其配制MOPS缓冲液（10）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )50mmol/L NaAc10mmol/L EDTA准确称取41.86g MOPS, 6.8g NaAc, 3.72g EDTA，先用适量的用DEPC处理的水溶解NaAc，再将MOPS溶解其中，再加入已用同样方法处理水溶解的EDTA，混匀后用2mol/Ld NaOH将调整pH 至7.0，最后定溶至1000ml，过滤灭菌后避光保存。上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝其它试剂：甲醛（37%溶液，13.3mol/L）甲酰胺（去离子）将10ml甲酰胺和1g离子交换树脂混合，室温搅拌1 小时后用Whatman滤纸过滤。等分成1ml于-70贮存。溴化乙锭（EB，10mg/ml）70%乙醇试验程序1将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。2配制琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热溶化均匀。3待胶凉至6070时，依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10MOPS缓冲液和0.5l溴化乙锭，混合均匀后立即灌胶（注意避免产生气泡）。4样品制备：取DEPC处理过的500l小离心管，依次加入10MOPS缓冲液2l、甲醛3.5l、甲酰胺（去离子）10l、RNA样品4.5l，混合均匀；将离心管置于60水浴中保温10min.，再置于冰上2min.；向每管中加入3l上样染料，混匀。5上样：将制备好的凝胶放入电泳槽中（上样孔一侧靠近阴极），加入电泳缓冲液（1MOPS缓冲液），液面高出胶面12mm，小心拔出梳子使样品孔保持完好。用微量移液器将制备好的样品加入加样孔，每孔上样2040l。6电泳：盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于7.5V/ml的电压下电泳2小时左右，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果。RNA样品质量分析：完整的总RNA样品应呈现出三条条带，分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应约为18S rRNA条带亮度的2倍，这表明RNA样品比较完整，基本无降解。如果两条带的亮度反过来，则说明RNA样品已发生降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。植物总RNA中28S rRNA及18S rRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kb RNA的迁移率，以此可作为分子量的参考。三、为制备RNA探针模板的DNA片断亚克隆A 载体选择为了获得能够在体外转录RNA探针的DNA模板，其克隆载体必须带有可供选择的特异转录启动子，同时，为了获得理想的Northern杂交试验结果，载体选择带有两种不同类型而方向相反启动子的载体，以便在RNA探针制备时同时得到两条链的转录探针。常用的这类载体有：pGEM-3/pGEM-4 ( 2.87kb, SP6/T7 ).pGEM-3Z ( 2.74kb, T7/SP6 ).PGEM-3Zf(-) (3.2kb, T7/SP6 ).Bluescript M13- (2.96kb, T7/T3 ).按照试验的经济有效原则，本试验选用 Bluescript M13-。B. 目的DNA序列与载体连接从所建立的cDNA文库中挑选出带有目的DNA片断的克隆，扩增后提取质粒，采用限制性内切酶处理或采用PCR特异扩增的方法分离出目的DNA片断；采用标准质粒提取方法提取载体质粒（见黄健试验）。然后按下列程序进行连接。试剂及其制备T4 DNA连接酶连接缓冲液（可直接购买或配制），10X 缓冲液配方为：0.5 mol/L Tris-HCl pH 7.80.1 mol/L MgCl250mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）ATP 5mmol/L ( 如果直接购买商品缓冲液，有的已加在缓冲液中，但有些需单独加入)。BSA 0.25mg/LPEG (35008000均可，在缓冲液中加入2%3% 的PEG可提高平端连接效率)。无菌蒸馏水（SDW）试验程序1 建立以下反应体系（终体积20l）：4l 质粒 ( 50g/l)6l 目的DNA ( 100g/l)2l 10X 连接缓冲液2l DNA 连接酶6l 无菌蒸馏水2 反应管置于15条件下保温反应24小时，65加热10min.终止反应。3取510l连接反应物用微型凝胶电泳检测连接效果，其余反应物于-20保存备用。注意事项1保证连接反应中目的DNA与质粒载体的浓度比例在31，因为高浓度的DNA有利于片断与载体的连接，低浓度的DNA则会增加载体自连。2DNA连接酶对温度敏感，在15以上会迅速失活，因此，连接反应的温度控制必须严格。3为了保证RNA探针的质量，模板DNA片断的完整性和纯度十分重要，在DNA制备时要严格控制。C感受态细胞制备（CaCl2法）试剂及其配制LB培养基（200ml）：2g胰蛋白冻、1g酵母浸膏、2g NaCl，溶解后调整pH至78，定溶到200ml混匀，分装成50ml/瓶后灭菌4保存。CaCl2 0.1mol/L，4保存。E. coli菌株：JM105或TG1。试验程序1将单菌落菌株接种于5ml LB培养基中，在37条件下振荡培养过夜。2取0.5ml过夜培养的菌液接种于50ml LB培养基中，在37条件下振荡培养约3小时，用分光光度计检测OD6000.30.4时，取出培养瓶置于冰上完全冷却。3将菌液转入离心管中，在4条件下，3500rpm离心510min.，弃去上清液。4将沉淀悬浮于预冷的25ml 0.1mol CaCl2中，在冰上放置30min.后，于4条件下，3500rpm离心510min.，弃去上清液。5沉淀重悬于2ml 预冷0.1mol CaCl2溶液中，菌液直接用于转化。或加入1.6ml 80%甘油，按每管200l分装于2ml的冻存管中，于液氮中速冻后-70保存备用。D. 质粒DNA转化试剂及其配制LB培养基（同C）。氨苄青霉素：用无菌蒸馏水配制成50mg/ml的贮存液。含氨苄青霉素（AP）的LB平板：每升LB培养基中加入15g琼脂，溶化后高压灭菌，待稍凉后再加入氨苄青霉素至终浓度为50100g/ml。在超净工作台上用9cm灭菌培养皿铺板。IPTG（isopropylthio-D-galactoside 异丙基硫代-D-半乳糖苷）：取2g溶于8ml双蒸水中，定容至10ml，过滤灭菌后-20保存。X Gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)：贮存液浓度为20mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中，-20黑暗保存。试验程序1取制备分装好的感受态细胞，置于冰上5min.，加入连接产物10l，轻轻混匀后置于冰上30min.。2然后置于42水浴中热击细胞50s.，再置于冰上2min.。3向各管中加入200l在37下预热的LB培养基，37下振荡培养1小时。4与此同时，将LB平板置于37下片刻，每板加入44l IPTG/X-Gal (4l IPTG和40l X-Gal )均匀涂布于平板表面放置约10min.使其吸附渗透。5将步骤3中培养的菌液涂布在制好的平板上，吹干后（在超净工作台中放置片刻）置于37下培养过夜。含有插入片断的菌落为白色。E. 转化质粒的快速检测试剂及其配制煮沸缓冲液：蔗糖 8Triton X-100 1.5%EDTA(pH 8.0) 50mmol/LTris-HCl(pH 8.0) 10mmol/LLB培养基（同C）氨苄青霉素（AP）（同D）试验程序1选取白色单菌落，接种到3ml含AP的LB液体培养基中，37下振荡培养过夜。2将培养物等分成2份按菌落编号，每一菌落编号切勿出错。一份于4下保存备用，每一菌落编号切勿出错。另一份转入Eppendorf中，7000rmp离心2min.，弃去上清液，吸干残留液体。3将沉淀菌体细胞悬浮于350l煮沸缓冲液中，加入25l溶菌酶后，涡旋混合。4将管置于100沸水中煮40s.，取出立即在12000rmp条件下离心15min.。5取10l上清液，加入溴酚蓝染料后，在0.8%琼脂糖胶上电泳。6在紫外灯下根据分子量检测插入片断的完整性。如果不能确定转化片断的大小，则要进一步杂交、测序分析。选取经检测含有完整目的DNA片断的菌落，转接于2ml TB培养基（每升16g胰化蛋白冻/10g酵母提取物/5g氯化钠）中，37下振荡培养过夜，取850l菌液加入到一2ml的冻存管中，再加入150l 50%的甘油，混匀后置于液氮中快速冷冻，再置于-70条件下保存。四、模板DNA的制备A质粒DNA的小量提取试剂及其配制含AP的LB液体培养基TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)1mmol/L EDTA (pH 8.0)溶液I： 25mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)10mmol/L EDTA50mmol/L 葡萄糖高压灭菌15min.后，4贮存。溶液II: 0.2mol/L NaOH1% SDS（临用前现配制）溶液III（100ml）：5mol/L 乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5mldH2O 28.5ml4贮存。酚氯仿（11）95%和70%乙醇试验程序1在纯净工作台上将5ml含AP的LB液体培养基加入到一1015ml通气良好的试管中，然后将前述经鉴定含有目的DNA片断的转化细菌接种其中，37下振荡培养过夜。2取1.5ml培养物置于一微量离心管中，在4下12000rpm离心2min.，弃去上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。3将细菌沉淀重悬于100l溶液I中，剧烈振荡后加入200l新配制的溶液II，盖紧离心管口，将其快速颠倒5次（切勿振荡），再加入150l在冰上预冷的溶液III，盖紧离心管口，将其倒置后轻轻地振荡使溶液III在粘稠的裂解物中分散均匀，再将离心管置于冰上35min.。4在4下12000rpm离心5min.，将上清液移至另一离心管中。5加入等量酚氯仿（11），振荡混匀，在4下12000rpm离心2min.，将上清液转入另一离心管中。6加入二倍体积95%乙醇，振荡混匀，室温放置20min.，在4下12000rpm离心5min.，小心弃去上清液，倒置将液滴除尽。7用70%乙醇洗涤一次，室温干燥10min.，用50l含20g/ml胰RNA酶（无DNA酶）的TE重新溶解质粒DNA，取1l 在含溴化乙锭的微型胶上进行电泳检测，其余置于-20保存备用。B 质粒DNA的线性化试剂及其配制Not I和Sal I内切酶及其相应的缓冲液酚氯仿（11）3mol/L NaAc(pH 5.2)100%和70% 乙醇DEPC-H2O试验程序1在离心管中依次加入：质粒DNA 10l (1g/l)10内切酶缓冲液 10ldH2O 80lSal I或Not I 2l(10U/l)237保温反应2小时以上。3消化液用100l的酚氯仿（11）、氯仿各抽提一次，每次在在4下12000rpm离心5min.4将上清液转入一新的离心管中，加入0.1倍体积3mol/L