RT-PCR法探讨茉莉酸甲酯对Taxol生物合成的影响

RT-PCR法探讨茉莉酸甲酯对Taxol生物合成的影响陈小文 段留生 董学会*中国农业大学 农学与生物技术学院 北京 100094摘要：本试验应用HPLC法测定了茉莉酸甲酯（MJ）处理后，东北红豆杉叶片中紫杉醇含量的变化，并运用RT-PCR技术检测了紫杉醇生物合成7个相关基因的表达差异，结果表明MJ在处理后第20天，紫杉醇含量明显高于对照；7种关键酶基因的表达活性在处理后第4天明显提高，其中GGPPS活性为对照的6.65倍，TBT活性为对照活性的941%。关键词： 紫杉醇 GGPPS 紫杉烯合酶 生物合成Exploration of the Changes in Key Taxol Biosysthesis Processes when Treated by Methyl Jasmonate (MJ) Resorting to RT-PCRChen Xiao-wen , Dong Xue-hui* ,Duan Liu-shengCollege of Agricultural and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094, ChinaAbstract: HPLC was used for content detection taxol in leaves of Taxus cuspidata, and the method of RT-PCR was applied for check of expression activities of the seven key genes in taxol biosysthesis. The results showed that the accumulation of taxol in treatment was notably higher than that in control, and the expression of the seven genes were more active on the fourth day after treatment, for example, the GGPPS activity was 6.65 times that in control and TBT activity was 941% of that in control.Keywords: Taxol GGPPS taxadiene synthase Methyl Jasmonate前言紫杉醇（taxol），从红豆杉属植物中提取的二萜类次生代谢物，是一种广普的抗癌药物，可应用于治疗乳腺癌、子宫癌和肺癌以及与爱滋病相关的Kaposi肉瘤等，但该成分在红豆杉中的含量很低，而且野生的红豆杉资源有限，目前人工栽培红豆杉植物是紫杉醇最主要的来源1，2。茉茉莉酸或茉莉酸甲酯是已经确定的植物防御反应中基因信号转导系统中的主要信号转导分子3,4，已有文献报道茉莉酸甲酯能提高taxol、Baccatin 和Baccatin 等紫杉烷类化合物的产量5，是紫杉醇生物合成的诱导剂6。虽然目前对紫杉醇生物合成研究逐步深入，其合成途径的也逐渐阐明 7-9 , B.H. Guo10等还对此作了详细的描述（见图1），但一些外源物质对紫杉醇合成的作用机理还没有无明确报道。目前用于临床的紫杉醇主要是从红豆杉的树皮和针叶中提取的，如何提高植株中利用人工繁殖栽培扩大红豆杉资源是目前的紫杉醇资源的可靠途径，而针叶是红豆杉植株中可再生的部位，因此如何适时采收以保证紫杉醇的含量较高是目前比较需要探讨的问题。本试验运用RT-PCR技术检测了茉莉酸甲酯处理后紫杉醇生物合成中GGPPS、10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyl transferase(DBAT)、taxoid 10-beta hydroxylase、taxadiene synthase (tasy)、taxadiene 5-alpha hydroxylase 、taxadien-5-alpha-ol-O-acetyltransferase、2-alpha-hydroxytaxane 2-O-benzoyltransferase (TBT)7个相关基因的表达差异，希望能进一步了解紫杉醇生物合成的代谢途径，为生产中红豆杉的合理采收提供理论依据。Taxol biosynthetic pathway. ggpps: geranylgeranyl diphosphate synthase; ts: taxadiene synthase;h-5_: cytochrome P450 taxadiene 5_-hydroxylase; tat: taxa-4(20), 11(12)-dien-5a-ol-O-acetyltransferase; h-10_: cytochrome P450 taxane 10_-hydroxylase; tbt: taxane 2a-O-benzoyltransferase; dbat: 10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyltransferase. Multiple arrows indicate several as yet undefined steps.图1 紫杉醇生物合成图（B.H. Guo et al, 2006）1 材料和方法1.1 试验材料东北红豆杉扦插两年苗购于黑龙江省苇河林业局。选取生长健壮较一致的扦插苗于温室（白天20，晚上4）中缓苗18天后，结合试验三的结果，选取100M.L-1茉莉酸甲酯进行喷施处理，对照喷施蒸馏水，平均每株4ml处理液。分别于第4、8、12、16、20天取当年生新叶，用纱布包好部分样品放到液氮中30min后置于-80低温冰箱中保存用于荧光定量PCR测定taxol合成中相关基因的活性表达，余下样品于65烘箱中烘干至恒重用于紫杉烷类物质检测，每个样品3次重复。1.2测定方法1.2.1紫杉醇及其前体含量的测定 紫杉醇及其前体的提取：称取烘干样品0.2g放到10mL试管中，加入4mL甲醇于超声波清洗器中超声处理0.5h，取出浸泡液10000r/min下离心5min，取上清于通风厨中吹干后用1mL甲醇溶解，经022m微孔滤膜过滤，供HPLC分析紫杉醇（Taxol）、巴卡亭III（Baccatin III）与10-去乙酰基巴卡亭III（10-DAB）。HPLC分析参考Jianwen Wang 11等方法。1.2.2总RNA提取：用玻璃或强力匀浆器搅匀组织样品，每500m g样品，加入0.05g石英砂及0.05gPVP，液氮内用研钵磨碎，转入预冷的1.5ml 离心管中。在离心管中加入1.5ml变性液，-70C冻融两次，56C温育1-3 min。将离心管放于冰上，分为两管，每管加入750ul 2mol/l 的NaAc-Hac（pH4.0），冰浴10 min，4C 12000rpm离心10 min，转移上清至一干净的管中。加入 500ul 5mol/l 的Kac，冰浴20min，4C 12000rpm离心10 min，转移上清至一干净的管中，加入750ul水饱和酚，150ul氯仿/异戊醇，震荡混合均匀，冰浴10 min，4C 15000rpm离心30 min ，转移上清至一干净的管中，加入等体积异丙醇，-20C 1小时，4C 13000rpm离心25 min 。去上清，100ul DEPC水溶解，加入1ml的裂解液RL裂解。在15 -30C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。每1mlRL加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。于412，000rpm 离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RL体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作。加入1倍体积70乙醇，颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管内）。10，000rpm 离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。加500l 去蛋白液RE，12，000rpm 离心45秒，弃掉废液；加500l 去蛋白液RD，12，000rpm 离心45秒，弃掉废液；加入700l漂洗液RW，12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。加入500l漂洗液RW，12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。将吸附柱RA放回空收集管中，12,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加50-80l RNase free water（事先在 65-70水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000 rpm 离心1分钟。如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟,或者另外再加30l RNase free water，离心1分钟，合并两次洗脱液。1.2.3cDNA合成：在冰浴的试管中加入模板总RNA 2g、引物Oligo(dT)18 (0.5g/l) 1l，然后用无RNA 酶去离子水定容至11l。轻轻混匀后，在70水浴5 分钟后，冰浴。将试管冰浴，再加入4l 5Reaction Buffer、0.5lNase Inhibitor (40U/l) 、2ldNTP Mix(10mmol/L)，加水至19l，轻轻混匀后，在37水浴5 分钟。轻轻混匀后离心35 秒。加入1l M-MLV RT（200U/l），终体积为20l。反应混合物42水浴60 分钟。在70加热10 分钟结束反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。1.2.4定量PCR 引物合成见表1，荧光定量PCR反应体系为每个管中加入cDNA4l，10pm/l引物各1l，SYBR PCR mix25l，去离子水17l，总体积50l；反应程序如表2。反应结果可用如下公式计算：表达量比值=2-Ct（其中Ct=Ct目的基因（样品）-Ct管家基因（样品）- Ct目的基因（对照）-Ct管家基因（对照）表1 定量PCR引物设计酶正向引物反向引物taxadien-5-ol-O-acetyltransferasetaxoid 10- hydroxylasetaxadiene 5-hydroxylaseDBATtaxadiene synthase (tasy)TBTGGPPS18sTAGTATATGCGATGGACGAGGAGACATGGCAAGTAGTTCAGG TTCTTCTCTGCTCCATGCCTCCACAATCGTGACACCCCGTTCTGGGTCCTGGTCCTGTCGTAATGATGTAGATATGATTGAGCGAGTGGCTGAATTGGCGACGAGAGACAGGTCTGTGATGCCCTTAGAGTGTATAGGATCTTCAGGCTTCAGCATGTGTAGTATAAGGCGTCGATAGCATTCTGGATTGGAAGGTCTACTTCATCAAATCCCAATCGACCTTGCTAGTGCCAGTGCCTGGGAGGCATTGTAGACTGGCCTGAATGCAATGTAATCTGTACTGGGAATTCCTCGTTCATG表2 PCR反应程序循环数Step温度时间检测说明11952 minoff起始模板变性4019515 secoff模板变性260-6515 secoff退火37230 secon延伸80160-6610 sec+0.5每增加0.5反应10s2 结果与分析2.1喷施MJ对紫杉醇的含量影响从图3中可以看出喷施MJ后叶片中紫杉醇的含量的变化趋势在前16天和对照的变化趋势一致，且无显著差异，但到了第20天，对照中紫杉醇含量有所降低，而MJ处理的紫杉醇含量有所上升，其含量为对照的2.4倍，差异显著。图3 茉莉酸甲酯（MJ）对紫杉醇含量的影响2.2喷施MJ对紫杉醇生物合成代谢相关基因表达的影响图4东北红豆杉RNA定量PCR产物图谱从图4可以看出，叶片中提取得细胞总RNA条带清晰，可以用于定量PCR检测，检测结果（见表4）表明： MJ处理能有效激发各种关键酶基因的表达,但不同基因应答诱导的特点不一样，同一基因在处理后不同时间的表达也有所不同。茉莉酸甲酯处理后第4天，7种关键酶基因均受诱导表达，其中GGPPS、 taxadien-5-alpha-ol-O-acetyltransferase和2-alpha-hydroxytaxane 2-O-benzoyltransferase (TBT)应答诱导处理比较敏感，在第4天3种基因的表达量分别为对照的5.28、6.65和9.40倍，说明这3种基因较其他几种基因而言，不太可能限制紫杉醇的生物合成，而taxoid 10-beta hydroxylase、taxadiene 5-alpha hydroxylase、10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyl transferase (DBAT)和taxadiene synthase (tasy)相对表达的提高量较小，暗示这些基因更可能是紫杉醇生物合成调控的关键步骤。随处理时间的延长，这7种关键酶基因的表达较对照有所降低，这可能是前期的过量表达，使得后期出现负调节。表4 MJ处理后7种关键酶基因的相对表达酶4d8d12dtaxadien-5-alpha-ol-O-acetyltransferasetaxoid 10-beta hydroxylasetaxadiene 5-alpha hydroxylase10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyl transferase (DBAT)GGPPStaxadiene synthase (tasy)2-alpha-hydroxytaxane 2-O-benzoyltransferase (TBT)5.282.642.001.956.653.829.400.630.591.411.120.491.950.980.140.260.140.140.120.470.603.讨 论茉莉酸甲酯对紫杉醇生物合成过程中的相关基因具有诱导表达作用，叶片喷施MJ后，所检测的7种关键基因的表达活性在第4天均有所提高。已有研究报道,紫杉醇及其前体物质在红豆杉中的合成部位和积累部位存在差异，也即对于红豆杉的一个具体部位而言,紫杉醇的含量的变化与其前体含量的变化趋势不完全同步12，13。在我们的试验中，MJ处理后，首先诱导紫杉醇生物合成前体合成向关基因的表达，为相关前体物质的合成奠定了基础，同时也为后期紫杉醇含量的提高提供了前提条件，因而紫杉醇的含量在第20天才较对照有显著提高，这也间接验证了刘智等人关于紫杉醇含量变化和前体含量变化趋势存在差异的观点。参考文献1 余琨，丁艳涛，孟宪碌，等. 紫杉醇在我国的应用近况J. 肿瘤防治杂志，2001，8（4）：440443.2 Schiff P B，Fant J，Horwitz S B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxolJ. Nature，1979，277：665667.3Sembdner, G. and Parthier, B. The biochemistry and the physiological and molecular actions of jasmonates. Annu. Rev. Plant Physiol. 1993，44: 569589.4 R. Ozawa, G. Arimura, J. Takabayashi, T. Shimoda, T. Nishioka,Involvement of jasmonate and salicylate related signaling pathways for the production of specific herbivore -induced volatiles in plants,Plant Cell Physiol. 2000 ,41；391398.5 Ketchum R.E., Gibson D.M., Croteau R.B., and ShulerM.L., The kinetics of taxoid accumulation in cell suspension cultures of Taxus following elicitation with methyl jasmonate, Biotechnol. Bioeng., 1999, 62(1): 97-105.6Yukimune Y，Tabata H，Higashi Y，Hara YMethyl iasmonateinduced overproduction of paclitaxel and baccatin III in Taxus cell suspension culturesNat Biotechno11996,14：l129-l132 7 骆建新, 陈永勤, 刘占杰. 紫杉醇生物合成相关酶基因的克隆与表达. 中国生物工程杂志, 2003, 23 (6) : 35-40 8 黄新, 黄璐琦, 邱德有. 紫杉醇生物合成途径中相关酶的研究进展. 中国生物工程杂志, 2002, 22 (5