荧光的原理及应用

荧光光谱的原理与应用，冯瑞福州大学实验中心，2，主要内容，1，荧光光谱的基本原理，1，荧光光谱仪的原理、操作和数据处理，2，荧光光谱的应用，3，参考物质，4，3，荧光光谱的基本原理，4，荧光的定义，荧光是一种辐射跃迁，即当一种物质从激发态失去到具有相同多重性的低能态时所释放的辐射。结构原理：原子或分子中电子排列遵循的规则。基态和激发态，最低能量原理泡利不相容原理亨特法则，基态：当分子中所有电子的排列遵循结构原理时，分子被称为处于基态。激发态：当一个分子的电子构型不完全符合结构原理时，它就被称为处于激发态。6，电子激发态的多重性：M=2S 1S是电子自旋量子数的代数和(0或1)；根据亨特规则(平行自旋比成对自旋更稳定)，三重态能级低于相应的单重态能级。大多数有机分子的基态是单线态。7、分子能级比原子能级更复杂；在每个电子能级，都有振动和旋转能级。分子能级和跃迁，激发：基态(S0)激发态(S1，S2激发态振动能级):吸收特定频率的辐射；量化；过渡是一次性到位的。去激活：激发态基态：各种方式和手段(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的路径占主导地位。第一，第二，电子激发单线态S1，S2，第一，第二，电子激发三重态T1，T2，8，杰布隆斯基分子能级图，9，跃迁规则，当原子核的构型在跃迁前后没有改变，电子的自旋在跃迁期间没有改变，跃迁前后的电子轨道在空间上有很大的重叠并且轨道的映射已经改变时，跃迁是允许的；在跃迁过程中，电子自旋发生变化，跃迁前后的电子轨道在空间上不重叠，或者轨道的对映体性质不变。过渡是禁止的。弗兰克-康登原理：当电子跃迁完成时，分子中原子核的构型不能及时改变。10、电子在激发态是不稳定的，容易回到基态，在这个过程中通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量，这个过程称为失活。激发态具有短的停留时间和快的返回速度，并且具有高的发生概率。去活化的方式，11，振动弛豫：在相同的电子能级内，以热能交换的形式，从高振动动能级到低相邻振动能级的转变。振动松弛时间一般为10-12s。无辐射跃迁失活方式，通过内部转换和振动弛豫，高激发态单线态电子跳回到第一激发态单线态的最低振动能级。内部转换：具有相同多重权重的电子的中间能级之间没有辐射能级跃迁。12，无辐射跃迁去激活途径，系统间跃迁：不同多重态和重叠旋转能级之间的无辐射跃迁。改变电子自旋和阻止电阻跃迁是通过自旋轨道耦合实现的。外部转换：激发分子和溶剂或其他分子之间相互作用以传递能量的非辐射转换；外部转换减弱或“淬灭”荧光或磷光。13，荧光发射：电子从第一激发态单线态基态(主要是S1S0跃迁)的最低振动能级发射波长为2的荧光；10-7 10-9秒.辐射跃迁失活、磷光发射的方式：电子的最低振动能级从第一激发态三重态基态(主要是T1S0跃迁)；发射波长为3的磷光；10-4 100秒.电子从S0进入T1的可能过程：(S0T1禁阻跃迁)S0激发振动弛豫内部转换体间交叉振动主要光谱参数，发射光谱固定激发波长(通常固定在感兴趣的激发带的峰值位置)，扫描出化合物的发射强度(荧光/磷光)和入射光波长曲线。吸收光谱复合吸收强度和入射光波长曲线。15，主要光谱参数，吸收光谱反映了物质的基态能级和激发态能级之间的所有允许跃迁。物质在正常状态下的表观颜色主要取决于其吸收特性。激发光谱反映了基态和与荧光发射相关的所有能级之间的跃迁。呈现的关系比吸收光谱更具选择性，但有时不如吸收光谱直接。当电子跃迁到不同的激发态能级时，它们吸收不同波长的能量(例如图2和图1中的能级)以产生不同的吸收带，但都返回到第一激发态单线态的最低振动能级，然后跃迁回到基态以产生特定波长(例如2)的荧光。因此，发射光谱的形状与激发波长无关。16，斯托克位移，一个化合物的发射光谱通常与其吸收光谱非常相似，但它总是从相应的吸收光谱红移，这被称为斯托克位移。溶液中蒽的吸收光谱(虚线)和发射光谱(实线)是斯托克位移的主要原因：1。跃迁到具有高振动动能能级的激发态的受激分子首先以更快的速率(其速率约为1013/s)经历振动弛豫，失去一些能量，达到零振动能级，并且通常从零振动能级发射荧光；2.激发态形成后，其分子构型将很快进一步调整，达到激发态的稳定构型，这又会损失一些能量；3.发射荧光的激发态大多是(， *)态，它们的极性比基态大，因此它们将在更大程度上被极性溶剂稳定，进一步降低激发态的能量。斯托克街18号。然而，在高温下有时会观察到反斯托克斯频移现象，即荧光光谱向吸收光谱的短波方向移动。这是因为高温使得更多被激发的分子处于高振动能级，并且荧光主要从激发态的高振动能级发射。无论是斯托克位移还是反斯托克位移荧光都不称为共振荧光。反斯托克斯频移，19，荧光发射是光吸收的逆过程。荧光发射光谱和吸收光谱具有镜像关系。然而，当激发态的构型与基态的构型大不相同时，荧光发射光谱将与化合物的吸收光谱显著不同。20、荧光光谱镜规则，固定激发光波长材料发射荧光强度和发射光波长曲线，如右侧曲线二。荧光本身是辐射跃迁过程产生的光，在这一过程中，电子不会在两个能级之间发生自旋反转。磷光光谱显示了由具有固定激发光波长的物质发出的磷光强度与发出光的波长之间的关系曲线，如右图中的曲线三所示。磷光本身是在两个能级之间自旋反转的电子辐射跃迁过程中产生的光。荧光光谱和磷光光谱，21，光谱图，22，自吸收现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，导致自吸收；例如蒽化合物。内部过滤：溶液中含有能吸收激发光或由荧光物质发出的荧光，如色氨酸中的重铬酸钾；内部过滤和自吸收现象，23，荧光寿命，荧光寿命是荧光强度衰减到初始值的1/e所需的时间，通常表示为。例如，荧光强度的衰减符合指数衰减规则：It，其中I0是激发时的最大荧光强度，它是时间t时的荧光强度，k是衰减常数。，荧光寿命，所以有F1/kF，F代表荧光分子的固有荧光寿命，kF代表荧光发射率的衰变常数。荧光发射率是单位时间内发射的光子数。26，处于激发态的分子将通过除发射荧光之外的一些其它过程(例如猝灭和能量转移)返回基态。结果，激发态分子返回基态的过程(或失活过程)加快，结果荧光寿命缩短。寿命与这些过程的速率常数有关。总去活化过程的速率常数K可以表示为各种去活化过程的速率常数与代表各种非辐射过程的衰变速率常数的33，360 KKFKI之和。那么总寿命是：1/k1/(kfki)，荧光寿命是27。因为吸收概率与发射概率相关，所以f也与最大吸收位置处的摩尔消光系数max(单位是cm2mol-1或(mol-3)-cm-1)密切相关。f的粗略估计值(以秒为单位)可以从下面的等式中获得。1/f 104max，注意：在讨论寿命时，不要把寿命和跃迁时间混淆。跃迁时间是跃迁频率的倒数，而寿命是指分子以特定状态存在的时间。通过测量寿命，我们可以获得关于分子结构和动力学的信息。荧光寿命，28，延迟荧光，一般荧光寿命为10-8s，最高达10-6s但是有时可以观察到长达10-3秒的时间。这种长寿命的延迟荧光称为延迟荧光或延迟荧光。延迟荧光与普通荧光的区别主要在于不同的辐射寿命。这种长寿命的延迟荧光源于从第一激发态三重态(T1)再生的S1态的辐射跃迁。即，延迟荧光产生的过程是：S1T1S1S0 hf，29。延迟荧光和E型延迟荧光：当第一激发态单重态S1和第一激发态三重态T1之间的能量差小时，T1态有时可以从环境中获得一定量的热能，然后以较高的能量达到S1态。也就是说，T1S1首先从四溴荧光素(曙红)中观察到，因此命名为E型延迟荧光。，P型延迟荧光：当单重态(S1)和三重态(T1)之间的能量差大时，T1不能通过从环境获得热能而达到S1态。此时，当两个三重态分子接近时，有可能通过两个三重态分子的湮灭过程来再生S1态。也就是说，S1 t1 t1 (t1) s0S1 s0h p这一现象首先从芘和菲中观察到，因此命名为p型延迟荧光。30，荧光量子产率是物质荧光特性中最基本的参数之一，它指示物质发射荧光的效率。量子产率，通常用荧光量子产率来表示，定义为荧光发射量子数与被物质吸收的光子数之比，也可以表示为荧光发射强度与吸收光强度之比，或者表示为荧光发射速率与吸收光速率常数之比，即=荧光发射量子数/吸收的光子数=KFS1/吸收速率=If/Ia，31，量子产率，一般来说，荧光量子产率()不随激发光波长而变化，这称为卡沙-瓦维洛夫法则。然而，如果形成的激发态将导致化学反应或系统间交叉和内部转换之间的竞争，则它可能受到影响。例如，苯在低压气相中被254纳米的光激发，=0.4，而当苯被小于240纳米的光激发时，检测不到荧光。这是因为具有高振动动能级的苯的S1态会将其转化为脱蜡苯。不同的化合物差异很大。此外，它还会受到环境(如温度、溶剂等)的影响。)，例如，降低温度会导致化合物增加，升高温度会导致化合物减少。32，量子产率。由于荧光的非单色性、各个方向的不均匀性和二次发射，直接测量荧光量子产率的重复性往往很差。因此，实际测量中大多采用相对法，即在相同条件下，用已知荧光量子产率的参考化合物进行比较测量，目标化合物的荧光量子产率可由下式计算：S1 Scs/(IsC)，S、S、CS和IS分别为参考物质的荧光量子产率(已知)、摩尔消光系数、溶液浓度和荧光强度；、C和I分别是被测物质的荧光量子产率(未知)、摩尔消光系数、溶液浓度和荧光强度。参比应已知，无自吸收，无浓度猝灭，溶于被测物质所用的溶剂，易于纯化，稳定，对杂质不敏感。常用的参考文献有罗丹明B和喹啉硫酸氢盐等。33，荧光产生的条件，化合物能够产生荧光的必要条件是当它吸收光子以经历多次恒定跃迁时所吸收的能量小于破坏其最弱化学键所需的能量。此外，为了使化合物发出荧光，它的结构中必须有一个荧光基团。荧光基团是所有含有不饱和键的基团。当这些基团是分子共轭体系的一部分时，化合物会产生荧光。34、影响荧光的主要因素，1。荧光发色团和荧光发色团：能增强化合物荧光的基团称为荧光发色团。通常，它是给电子取代基，如-NH2，-OH等。相反，吸电子基团如-COOH，-CN等。会减弱或抑制荧光的产生，被称为荧光消色差基团。35，影响荧光的主要因素，增加共面稠环的数量，特别是当稠环以线性图案排列时，将有利于系统中的电子流动，从而减少系统转变所需的能量吸收，并进一步促进荧光的产生。2.添加稠环可以增强荧光：刚性增强后，分子的振动会减弱，因此分子的激发能不容易因振动而以热能的形式释放出来；此外，分子刚性的增加通常有利于增加分子的共面，这有利于增加分子中电子的迁移率，也有利于荧光的产生。3。增加分子的刚性可以增强荧光：36，这是影响荧光的主要因素。根据电子跃迁规律，当S1态的电子构型为(，*)态时，有利于荧光的产生，而当S1态的电子构型为(n，*)态时，不利于荧光的产生。4。激发态电子构型的影响：重原子具有增强系统间交叉的作用，这将增加从S1态到T1态的系统间交叉的速率常数和量子产率，从而导致荧光量子产率的降低。重原子会导致荧光量子产率的降低：37，影响荧光的主要因素，增加溶剂的极性一般有利于荧光的产生。6.溶剂极性的影响：降低系统温度可以提高荧光量子产率。温度的影响，如氢键、吸附、溶剂粘度增加等。可以提高荧光的量子产率，这可以通过减少分子的热振动和增加分子的刚性来解释。其他影响因素：38，39，荧光光谱仪的原理、操作和数据处理，40。在实验样品的激发下，通过选择合适的探测器和工作模式，记录发射光强度与激发源特性、样品特性、温度、时间、空间、能量等相关特性之间的关系，以便更好地研究或利用发光过程。41、荧光光谱仪的基本原理，样品制备，散装固体，为了获得尽可能理想的光谱，减少内外表面因素的干扰，最好切割成规则的形状，并抛光。2.如果你想比较一系列样品的特性，你应该尽量使它们在尺寸和平滑度上达到相同的规格。4.对于与各向异性相关的测试，必须注意光轴(或x、y、z轴)的位置。5.，43，液体，样品制备，1。溶液样品尽可能使用透明的玻璃化溶液，以避免在会聚光路中试管中溶液吸收不均匀造成光谱失真。2.为了安全起见，必须为使用挥发性和高毒性溶剂的测试提供适当的保护。3.易变和易腐的解决方案最好现在就测试。4.液体样品通常放在有盖的应时比色