双荧光素酶报告基因讲课稿.ppt

报告基因分析,1.基本概念和实验原理报告基因:编码可供检测的酶与蛋白质的基因。是现代分子生物学研究领域中用于分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具。,可作为报告基因的条件:编码产物的活性不受宿主细胞的干预。编码产物在宿主细胞中不存在,易于区别。编码产物的活性的测定必须具有快速、简便、灵敏度高、重复性好的特点。常用的报告基因：氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)、-gal、荧光酶基因(Luc),2.用途：基因转录调节的研究：最初的功能。作为分子标记的应用：如利用GFP作为标记物检测基因在植物酵母和哺乳动物细胞中的转移。生物大分子之间的相互作用：激活剂或拮抗剂在改变活细胞中受体活性作用等方面的研究。其他方面的应用：RNA干扰研究、影像技术及药物筛选等。,3.实验技术：基因克隆转染细胞产物检测,基因克隆的特点和技术路线,特点：分子水平上操作，细胞水平上表达技术路线：1分离制备目的DNA片段和载体2目的DNA与载体的剪切3目的DNA与载体的连接4重组DNA分子转化宿主细胞5筛选阳性克隆，大量扩增,在这个过程中：1.“基因剪刀”剪切DNA的酶就像一把“基因剪刀”2.“缝纫针”连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二者连在一起3.“交通工具”使用载体好比一辆车子4.“乘客”有用基因如IL2好比乘客，车子把乘客送进理想天堂（宿主细胞）去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治疗（IL2/LAK抗癌）。,一、目的基因的获取直接从染色体DNA中分离通过mRNA反转录合成cDNA从基因组DNA文库获取目的基因从cDNA文库获取目的基因PCR扩增目的基因人工体外合成基因片段,二、载体定义：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。特性：1复制起点(ori)2多克隆位点：多种限制酶的单一切割位点3筛选标志Amp+Kan+Neo+4分子量不宜过大否则易断裂、转化效率低5表达载体还要有P、E、前导序列、加尾信号、信号肽、核定位序列等,载体的分类,常用的报告基因载体类型：1）basic载体：不含P/E,用于检测启动子活性。2）control载体：含启动子，用于检测增强子或沉默子的活性。,酶切注意事项（最好双酶切）酶的保存：低温保存，冰上操作。贮存环境是甘油，避免反复冻融。酶切反应体系：酶量不能超过反应体积的1/10。反应缓冲液：合适的pH值、盐离子浓度，配套提供。DNA样品要求：一定纯度和浓度，不能混有酚、氯仿、EDTA、SDS、过多盐类等。温度和时间：通常371-2h反应终止：EDTA、SDS、加热、直接放入-20操作要求：无菌新的dorf管、枪头、去离子三蒸水。电泳鉴定酶切是否完全。,连接-定向克隆（最常用）方法：双酶切优点：防止载体自身环化正向插入单拷贝插入连接效率高,转化的原理和过程,感受态：细菌处于容易吸收外源DNA的状态。致敏：用理化方法诱导细胞进入感受态的操作。转化过程：1对数期细菌置于冷Cacl2、Mgcl2中，制备感受态2加入重组质粒，冰浴30分钟，不要震荡342水浴6090S，热休克4马上冰浴,第七节筛,抗药性筛选：amprtetrkanr插入表达筛选:蓝白斑筛选：测序菌落或噬菌斑杂交筛选酶切鉴定：插入否？插入方向？,转染：指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。若此DNA未与宿主细胞DNA整合而获表达，称“瞬时转染(transienttransfection)”；若与宿主细胞DNA整合并随后者的复制而复制称“稳定转染(stabletransfection)”。,转染方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。,注意事项：利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。,电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。脂质体法：人工合成的阳离子脂质体和带负电荷的核酸结合后形成复合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随