基因工程之DNA重组技术的基本工具.ppt

课标要求：现代生物科技专题拓展学生的生物科技视野,增强学生的科技意识,为学生进一步学习生物学类专业奠定基础。,模块解读,现代生物科技专题,课程标准中有关现代生物科技专题的核心知识的要求,细胞工程,本模块知识内容的构建顺序：基因工程细胞工程胚胎工程生态工程,分子水平,细胞水平,个体水平,群体水平,微观,宏观,中观,专题一基因工程,科技探索之路,1944年，艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。,科技探索之路,1953年，沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。,科技探索之路,克里克等提出中心法则,科技探索之路,1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。,基础理论和技术发展催生了基因工程,基因工程，又叫DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传特性。,基因工程的概念,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取4到5g。,1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。,治疗糖尿病特效药,据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。,胰岛素,思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？,某种药物蛋白的基因,烟草的DNA,如何实现药物基因在烟草中的表达，提前要做哪些工作？,准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）限制性内切酶,DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）DNA连接酶,基因转移工具（“分子运输车”）运载体,DNA重组技术的基本工具,学习目标,1、明确基因工程的原理。2、举例说明基因工程的操作工具、种类和作用。3、运用所学的DNA重组技术，模拟制作重组DNA分子模型。,自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？2.单细胞生物并没有在进化中灭绝，有何保护机制？,可能产生了一些特殊的酶来防范。可而这种酶能识别外来侵入的DNA并将其分解，而对自身的DNA不能起作用。,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶“分子手术刀”,2.为什么限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高等植物和动物中没有?,引导学生从噬菌体侵染细菌中获得灵感,为什么限制酶不能将自己的DNA分子剪切掉？,1、DNA分子不具备该种限制酶的识别切割序列；2、通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使了限制酶不能切开。,限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1.主要来源：2.种类与命名：,主要从原核生物中分离纯化,现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。,例如：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:,Hind、Hind和Hind,限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1.主要来源：2.种类与命名：3.功能（特异性）,识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要从原核生物中分离纯化,T,磷酸二酯键,A,限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1.主要来源：2.种类与命名：3.功能（特异性）4.限制酶识别序列,识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要从原核生物中分离纯化,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,限制酶的识别序列,限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1.主要来源：2.种类与命名：3.功能（特异性）4.限制酶识别序列5.作用结果：,识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要从原核生物中分离纯化,产生黏性末端或平末端,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,EcoR,黏性末端,黏性末端,Sma,平末端平末端,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,EcoR,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,不同来源的DNA片段混合,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,酶切,“分子缝合针”DNA连接酶,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,EcoliDNA连接酶或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,T4DNA连接酶,思考：“寻根问底二”DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？,DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的单链核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键,需要摸板。DNA连接酶是连接两个双链DNA片段的末端，形成磷酸二酯键,不需要摸板。,比较几种酶的作用,特定位置的磷酸二酯键,碱基对之间的氢键,脱氧核苷酸,DNA片段特定末端,DNA单链,全部的磷酸二酯键,DNA连接酶与DNA聚合酶是同一物质吗?,聚焦二：“分子缝合针”-DNA连接酶,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。,基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,运载体需要的条件：有1多个限制酶切点对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选常用运载体：细菌的质粒噬菌体的衍生物或某些动植物病毒,假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？,作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？,霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？,目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？,常用的载体：质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,限制性核酸内切酶（分子手术刀),识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要从原核生物中分离纯化,产生黏性末端或平末端,功能,来源,结果,DNA连接酶（分子缝合线),基因进入受体细胞的载体（分子运输车),功能,种类,种类,条件,对受体细胞无害。,Ecoli连接酶,将切下来的DNA片段拼接成新的DNA片段。,T4DNA连接酶,能在受体细胞中稳定保存并大量复制。,有一个至多个限制酶切割位点。,有特殊的遗传标记基因，便于筛选。,质粒、动植物病毒和噬菌体的衍生物。,总结,课下制作：使用EcoRI酶、E.coliDNA连接酶形成的DNA重组的模型，下节课展示。,CTGCAG,(1),GCCG,GCTTAA,GACGTC,GCCG,GTCA,AATTCG,(2),(3),(5),(6),(7),(8),GTCA,ACTG,可缝合两片断，上下左右颠倒颠,习题:已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因,现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么?请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论,质粒的构建与改造1)删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段装载量。2)灭活某些质粒的编码基因。3)加入易于识别的选择标记基因。4)加入特殊的基因表达调控元件。,一般来说，天然运载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的运载体进行人工改建。,1、关于限制酶的说法中，正确的是（）A限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列BEcoRI切割的是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中,练习,2、DNA连接酶催化的反应是()ADNA复制时母链与子链之间形成氢键B黏性末端碱基之间形成氢键C两个DNA片段黏性末端之间的缝隙的连接DA、B、C都不正确,3.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）A.同种限制酶B.两种限制酶C.同种连接酶D.两种连接酶,A,c,3、作为基因的运输工具载体，必须具备的条件及理由是()A能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件D能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选,A,4.基因工程常用的受体细胞有（）（1）大肠杆菌（2）枯草杆菌（3）支原体（4）动植物细胞A.（3）（4）B.（1）（2）（4）C.（2）（3）（4）D.（1）（2）（3）,B,5、在受体细胞中能检测出目的基因是因为()A目的基因上