农药生物测定实验指导

农药生物测定实验指导（研究生）实验一培养基的制作、灭菌和病原菌的接种、培养一、 实验目的：1、熟悉并掌握微生物用培养基的制作及灭菌的原理及使用；2、熟悉并掌握微生物的接种、培养及保存方法。二、 实验原理：培养基是供微生物生长的基物，分液体和固体两种。按成分又可分为天然培养基、半组合培养基和组合培养基。培养真菌所用的培养基一般用马铃薯培养基，它是半组合培养基，制作比较简单，且能够完全满足微生物的营养要求。灭菌是杀死所有微生物，保证培养基不被杂菌污染的重要手段之一。灭菌的方法有四种：热力灭菌、过滤灭菌、化学灭菌和物理灭菌。热力灭菌在微生物灭菌中占主要地位，分干热灭菌和湿热灭菌。干热灭菌是利用热空气来灭菌，将玻璃器皿等放入烘箱中加热，一般用160-170处理1小时或150处理2小时，适用于经高温处理不易损坏的干燥物质。湿热灭菌，即高压蒸汽灭菌，是将灭菌物放入灭菌锅内，维持一定的蒸汽压力，一般为1公斤/cm2左右（相当于121），维持半小时，以确保杀死所有微生物，适用于高温高压下不易分解变质的物质和玻璃器皿。湿热灭菌比干热灭菌效率高。病原菌接种培养是杀菌剂毒力测定经常进行的工作之一，因培养基性状不同，可采用不同的接种方法。本实验是练习在固体培养基上接种。固体培养基的接种方法分倾注和斜面两种接种方法。接种后的菌种，必须放在适温下培养，在培养期间注意观察菌种的生长情况和有无杂菌污染，温度要保持恒温，培养成熟的菌种必须很好地保存。三主要仪器及试材：1、 实验器皿：培养皿、容量瓶、移液管、无菌水、PDA培养基 注：以上器皿须经灭菌。 2、 实验仪器：超净工作台、灭菌锅、培养箱、打孔器、酒精灯等。四实验方法与步骤：（一）、培养基的制作：1、 培养基的组成（PDA）：去皮马铃薯块200克葡萄糖（或蔗糖）10-20克琼脂17-20克水1000ml2、 步骤：（1）、在大烧杯中加入1000ml的水，作上标记；（2）、称取去皮马铃薯200克，切成小块，放入盛有水的烧杯中，煮沸30分钟左右，将薯块捞出，留下汁液；（3）、称取17-20克琼脂（事先用水浸泡），加入烧杯中，煮溶后，称取葡萄糖（或蔗糖）10-20克，加入汁液中溶解。（4）、加水至标记处，趁热用双层纱布过滤；（5）、将制好的培养基在未凝固前及时分装。（二）、湿热灭菌：1、 在灭菌锅内加入去离子水到指定高度；2、 将须灭菌的物品放入灭菌锅内，将盖封闭加热；3、 当气压表指到0.3/ cm2时，排出锅内空气；4、 当气压升到所须压力（1公斤/ cm2，温度121）时，维持压力半小时；5、 灭菌完毕，缓慢放气；6、 取出锅内培养基，试管作成斜面，以备接种用。（三）、病原菌接种和培养：1、 试管斜面接种，用左手握好装有斜面培养基的试管和菌种试管的底部，右手拔出棉塞，靠近酒精灯火焰，将接种针在酒精灯焰上灼烧后，直接挑取少量菌丝和孢子或连同带菌的培养基小块，放入斜面培养基试管内，轻轻涂抹在斜面上。并在试管上注明菌种名称、接种日期、组名。五实验注意事项：1、 注意灭菌操作的方法和灭菌锅的使用方法。2、 病原菌的接种实验要注意无菌操作，整个实验操作过程在无菌操作台上完成。六实验结果处理：将接种后的菌种，放在适温下（28培养箱中）培养。并在培养期间注意观察菌种的生长情况和有无杂菌污染。七思考题：1、常用的灭菌方法有哪些？实验二杀虫剂精密毒力测定微量点滴法一实验目的：1、学习和掌握触杀毒力精密测定技术微量点滴法。2、学习农药生物测定数据的处理方法绘图法，最小二乘法和机率值分析法，求出致死中量（LD50）和致死中浓度（LC50）。3、明确杀虫剂杀虫毒力表示方法的意义和应用。二实验原理：在进行农药杀虫作用方式的实验后，了解某些化合物具有触杀作用的基础上，为了明确其触杀强度以及比较几种药剂的触杀毒力大小时，需采用精密触杀毒力测定技术来求出它的致死中量（或致死中浓度）。目前许多有机合成杀虫剂大多数都具有触杀作用，因而触杀毒力测定具有一定的重要性，测定方法虽然很多，但基本上可分为两大类：一是全部施药法：如定量喷粉法、定量喷雾法和用一定浓度药液浸渍法等。其优点是操作方便，比较符合实际施药情况。但药剂容易被试虫吞食产生胃毒作用。二是局部施药法：是目前比较精确的触杀毒力测定方法。一般包括药膜法和微量点滴法。微量点滴法是将一定浓度和容积的药液点滴在试虫体的一定部位，溶剂挥发后，药剂即可自体壁进入体内发挥触杀作用，药剂不致被试虫吞食。本实验采用微量点滴法来测定农药的触杀毒力作用。三主要仪器及试材：1、试虫：棉铃虫（3龄） 2、药剂：氯氰菊酯等3、实验仪器及用具：养虫室、毛细管点滴器、分析天平、滤纸、通针、培养皿（5cm）、容量瓶、具塞小试管及试管架、镊子、移液管、丙酮等。四实验方法与步骤：（一）试验前的准备工作1、试虫的移取：选取3龄棉铃虫，大小均匀一致的个体，放在垫有吸水纸的培养皿内，每皿10头，为一个处理。每个处理重复三次，分别在分析天平上称重，求出平均体重，备用。2、称药配药：将试药小心地移入洗净干燥的称量瓶中，在分析天平上准确称取一定量试药，放入小烧杯内，加少量丙酮溶解，再移入容量瓶中，加丙酮定容。摇匀即为母液，备用。3、毛细管点滴器的质量检定：检查毛细管微量点滴器是否通畅，并练习使用。（二）预备试验为了确定合适的施药浓度（或剂量）（要求试虫死亡率分布在20-80%范围内），在正式试验前，必须先用几个浓度或剂量（范围较大）进行试点滴，根据死亡结果，确定最合适的点滴浓度，预备试验所用试虫可以减少一半左右。（三）正式试验步骤1、药液的配制：根据预备试验结果，将容量瓶中的母液按等比级数用丙酮稀释成5个浓度，如1.6、0.8、0.4、0.2、0.1g/l等。每浓度5ml，装入具塞小试管。并以丙酮为对照。2、称重：将选好的试虫，在分析天平上称重，每个浓度为一个处理，每个处理10头试虫，重复三次，将每10头试虫放在垫有吸水纸的干净培养皿内，待处理。3、点滴：使用毛细管点滴器对棉铃虫（3龄）幼虫进行触杀毒力测定。首先进行预备练习，以毛细管点滴器吸丙酮点滴在滤纸上，反复多次，以点滴的大小均匀一致，每次均有为熟练。然后点滴虫体，先对照，再从低浓度到高浓度，每个浓度点滴虫体的中胸背部，每虫一滴，每浓度20头，重复三次。点滴药液量根据试虫大小确定，一般以试虫接受药液不从体壁上流失为宜。棉铃虫3龄幼虫，点滴量为0.3-0.5l，各处理试虫的点药量应一致。4、培养：处理完毕后，将处理过的试虫置于27的环境中，饲喂新鲜饲料，24小时，48小时后检查死虫数，以物触其虫体无任何反应者为死亡。五实验注意事项：1、目标试虫的选择：应选用具有一定的代表性及经济价值，耐药性较强、生长健壮、自然死亡率底，虫龄虫体大小一致，最好采用人工饲养的试虫。2、环境条件的选择：温度在20-28，相对湿度在60%-80%，通气良好。3、处理设计：每处理需试虫15-30头，重复三次，每次试验均要设空白对照，施药时要注意各处理用药等量均匀一致。4、实验中对照（CK）的死亡率最好小于10%，大于20%时实验必须重做。5、药液的配制中，要求不少于5个浓度梯度，各处理的死亡率在20-80%之间为最好。6、点滴操作过程中，点滴力度适宜，应避免力度过大而导致虫体损伤。并随时检查点滴器是否通畅。六实验结果处理：观察死活虫数，计算死亡率及校正死亡率，并将结果记入表中。 如自然死亡率超过20%，说明试虫群体生活力差或试验方法有问题，应重做。为了求得供试药剂的致死中量、需要根据用药浓度及体积求出每头试虫的受药量，并换算出单位虫体重的受药量。每头试虫受药量（微克）=每微升药液中含药剂微克数每头试虫受药微升数根据测定结果，以单位体重受药量（或每头受药量）的对数值为x，校正死亡率换算成机率值为y，求毒力回归方程y=a+bx，并求致死中量（LD50）值，且进行可靠性检验。七思考题：1、求出药量对数死亡率机率值毒力回归方程，求出供试药剂的致死中量。2、为什么要以致死中量或致死中浓度作为比较药剂毒力的标准。3、在实验过程中哪些地方容易出误差，如何克服。表1杀虫剂精密毒力测定原始数据记录表供试药剂浓度(%)每微升药液中含有药剂微克数每头试虫接受药液微升数每头试虫接受药量(微克)试虫平均体重(克)单位虫体重接受药量(微克药量/克虫体重)死亡率（%）校正死亡率（%）对照表2杀虫剂精密毒力测定数据换算表供试药剂单位虫体重接受药量或每头试虫受药量(微克药量/克虫体重)药量对数值校正死亡率（%）死亡率机率值毒力回归方程相关系数LD50实验三杀菌剂毒力测定生长速率法一实验目的：学习和掌握杀菌剂生长速率测定法的基本原理和实验方法。二实验原理：将不同浓度的药液和热的培养基混合形成含毒培养基，用这种含毒培养基培育病菌，以病菌的生长速率来计算杀菌剂的毒力。生长速率法适用于不长孢子而菌丝生长较快的真菌。三主要仪器及试材：1、 实验药剂：多菌灵，甲基托布津等；2、 供试菌种：水稻纹枯病菌等（培养皿菌种）；3、 实验器皿：培养皿、容量瓶、移液管、无菌水、PDA培养基 注：以上器皿须经灭菌。 超净工作台、灭菌锅、培养箱、打孔器、酒精灯等。四实验方法与步骤：1、 药液的配制：使用无菌水，将多菌灵配制成1000、500、200、50、20(g/ml)5个浓度，另设一个无菌水对照。2、 混药培养基平面的制作：将培养基（已灭菌）熔化，在无菌的条件下，取培养基9ml，加入1ml配制的药液于灭菌的培养皿，充分混合均匀，制成混药培养基平面，每浓度重复三次。3、 接种：使用打孔器打取菌块，用镊子将载菌的培养基小块放置在含药液的培养基表面，作好标签后，恒温培养。五实验注意事项：1、本实验要注意无菌操作，整个实验操作过程在无菌操作台上完成。2、药液和培养基混合时注意培养基的温度（70-80），并保证混合均匀；接种（菌块）前要冷却，接种时菌块的菌丝面向上。3、用打孔器打菌块时注意打孔器温度不要太高，以免影响菌种的生长。4、用打孔器打菌块时应在菌落的外缘打菌块，因外缘的生长力强，且差异小。六实验结果处理：供试菌培养约2-3天后，当对照处理的菌落长至近培养皿边缘时检查实验结果。以直尺十字交叉量取各菌落直径，以其平均数为菌落直径。在计算时注意减去打孔器的直径。计算抑制生长率：最后将各处理的生长抑制率换成机率值，以对数表示药剂浓度，用作图法求出有效中浓度EC50，以比较药剂毒力。七思考题：1、将实验检查结果记载于结果记载表中，并根据实验结果完成实验报告。2、比较各种药剂对病菌的毒力。3、讨论本实验方法的特点。表3杀菌剂生长速率测定法测定结果记载表供试菌种供试药剂药剂浓度（g/ml）菌落直径（mm）有无杂菌备注123对照表4杀菌剂生长速率测定法测定数据换算表供试药剂药剂浓度（g/ml）浓度对数值抑制率（%）抑制率机率值毒力回归方程相关系数LD50实验四除草剂温室盆栽实验叶面处理法一实验目的：防除杂草，保护作物是应用除草剂的目的，因此，除草剂的选择性就显得特别重要。本实验是通过一些除草剂对水稻和花生进行茎叶处理，比较不同的除草剂对不同的植物的作用差异，了解除草剂的选择毒性及除草效果。二实验原理：作物与杂草同时发生，而绝大多数杂草同作物一样属于高等植物，因此，要求除草剂具备特殊选择性或采用恰当的使用方式等而使除草剂获得选择性。除草剂的选择性原理大致可划分为5个方面：位置与时差选择性，形态选择性，生理选择性，生物化学选择性以及除草剂利用保护物质或安全剂获得选择性。三主要仪器及试材：1、供试药剂：10%草甘膦水剂、50%丁草胺乳油、12.5%盖草能乳油等。2、生物材料：水稻+稗草+鸭舌草、花生+稗草+水稻+野苋。3、实验用具：手压式喷雾器、烧杯、量筒、吸管、天平、花盆等。四实验方法与步骤：1、供试植物的培育：从稻田取回表层泥土，晒干，打碎后装入口径18cm的花盆内，加水浸泡2-3天，用小铁铲搅拌呈浆，沉淀后倒出水层，播入经催芽的稻种、稗种和鸭舌草。另外种花生的盆只需泥土潮湿，即可种入花生种子，并同时播种稻种、稗种和野苋等。2、药剂处理：当作物和杂草处于3-5片叶时，每小组分别选择水稻和花生各6盆，调查记录每盆的水稻株数和杂草株数（不同杂草种类分别记录）记于一小塑料标签上并插回该盆中，每次处理尽量使作物株数和杂草株数大致相等，然后分别用手压式喷雾器喷10%草甘膦11.25kg/ha；50%丁草胺1.5kg/ha；12.5%盖草能0.75kg/ha。水稻和花生各喷一盆，另两盆仅喷清水作为对照，每亩以喷60kg的药液量计，即每盆喷5ml。3、结果观察记载：喷药后7天调查试验效果。五实