02第二章-生物材料的预处理技术-调整-use

生物分离技术,第二章生物材料的预处理技术,固液分离,发酵液或其他细胞悬浮液,胞外上清液/滤液,预处理,提取生化物质的第一步，分两部分：,胞内富集细胞,发酵液成分很复杂，包含菌（细胞）体，胞内外代谢产物，及剩余的培养基成分等。首先要进行培养液(原料液)的预处理和固液分离，才能进行后续操作：胞外产物滤液代谢产物。胞内产物富集菌体(细胞)细胞破碎,为何要对原料液进行预处理？,由于所需的产品在原料液和菌体（细胞）中浓度很低，并与许多杂质夹杂在一起，同时发酵液或生物溶液又属于非牛顿型流体，所以必须进行预处理。,预处理的目的,预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：改变原料液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度；相对纯化，去除原料液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作；尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）。,预处理方法措施,一、降低原料液黏度二、凝聚与絮凝三、调整pH四、去除杂质不溶性多糖五、高价无机离子的去除六、杂蛋白的去除七、杂质DNA的去除八、原料液的脱色九、加入助滤剂和反应剂提高过滤效果,一、降低原料液黏度（1）加热：酶一般不耐热，温度不易太高；（2）加水稀释：降黏度的同时，增原料液体积，加大了处理量。,加热降低液体粘度降低液体粘度（加水稀释法和加热法）可有效提高过滤速率。,麦芽汁的黏度-温度曲线。,加热使蛋白质变性凝固变性蛋白质的溶解度小。如柠檬酸发酵液加热至80以上，可使蛋白质变性凝固，过滤速度加快。,二、凝聚与絮凝1、凝聚：靠电解质作用，胶体体系瓦解，胶粒之间双电层电排斥作用降低而凝集在一起的过程；所得凝聚体颗粒较小（1mm），效果不太理想。2、絮凝：胶粒(10-100nm)在高分子絮凝剂的作用下发生桥架连接作用而形成絮凝团的过程。所得絮凝体较大(10mm)，效果好。,凝聚：胶体粒子在中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm）机理：1）中和粒子表面电荷2）消除双电层结构3）破坏水化膜,1、凝聚Coagulation,原料液中细胞表面带有负电荷，由于静电引力使溶液中反离子被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。正离子同时受到使它们均匀分布的热运动影响，具有离开胶粒表面的趋势。,（1）胶体双电层结构,两种相反作用力下，双电层分裂成两部：1）吸附层；2）扩散层。形成了扩散双电层的结构模型。,胶体双电层结构,胶体双电层结构,不同界面上形成不同的电位:胶核表面的电位s是整个双电层的电位;Stern平面上的电位为d;滑移面上的电位为,称电位（电动电位）。,（2）凝聚机理,机理：1）中和粒子表面电荷2）消除双电层结构3）破坏水化膜,（3）常用的凝聚剂电解质：,硫酸铝Al2(SO4)318H2O（明矾）；氯化铝AlCl36H2O;三氯化铁FeCl3;硫酸亚铁FeSO47H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3,絮凝：胶粒在高分子絮凝剂的作用下发生桥架连接作用而形成絮凝团的过程。机理：架桥作用,2、絮凝flocculation,（1）絮凝机理,高分子絮凝剂的吸附架桥作用,絮凝剂：是一种能溶于水的高分子聚合物。长链状结构，其链节上含有许多活性官能团。分子量：几万1千万D（道尔顿）。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。架桥联结作用。,（2）絮凝剂,絮凝剂,有机高分子聚合物：聚丙烯酰胺类衍生物,无机高分子聚合物：聚合铜盐、聚合铁盐,天然高分子絮凝剂：壳聚糖、葡聚糖、海藻酸钠,微生物絮凝剂：新型絮凝剂，是一类由微生物产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。优点是安全，无毒和不污染环境。,可分为三类：人工合成有机高分子聚合物、天然有机高分子聚合物、无机高分子聚合物1）目前常用的是人工合成有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚乙烯亚胺衍生物；聚丙烯酸类和聚苯乙烯类衍生物。,工业上使用的絮凝剂,高分子聚合物絮凝剂根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：阴离子型（含有羧基)、阳离子型（含有胺基）、非离子型,聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点用量少，一般以mg/L计量；絮凝体粗大，分离效果好；絮凝速度快；种类多，适用范围广。,聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。,目前最常见：聚丙烯酰胺类絮凝剂,2）天然有机高分子絮凝剂,人工合成有机高分子絮凝剂虽然发展很快，但还存在着残留单体有毒，生物降解难等问题，所以其应用受到了限制。天然有机高分子絮凝剂具有无毒，易生物降解，原料来源广等优点。天然有机高分子改性絮凝剂根据其原料来源不同可分为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。其中淀粉改性絮凝剂的研究开发最引人注目。,3）无机高分子聚合物,有聚合铁系和铝系两大类铁系絮凝剂具有操作简单、费用低，受温度影响小，亲和力强，能有效地去除悬浮物、表面活性剂、破坏油水乳状液的能力很强等优点，缺点腐蚀性强、稳定性差。铝系是目前应用广、工艺较成熟的一类无机金属盐絮凝剂，絮凝效果好，缺点具毒性等。,微生物絮凝剂,微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，一类由微生物或其分泌物产生的具有絮凝细胞功能的代谢产物。包括直接利用微生物细胞的絮凝剂、利用微生物细胞壁代谢产物的絮凝剂和克隆技术所获得的絮凝剂主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。,微生物絮凝剂,1、微生物絮凝剂的商业化生产始于20世纪90年代，如红平红球菌及由此制成的NOC-1是目前发现的最佳微生物絮凝剂2、微生物絮凝剂或将大部分替代普通絮凝剂3、浮游藻类、草分枝杆菌、硅酸盐芽孢杆菌。,（3）絮凝的影响因素,发酵液的性质（细胞浓度，表面电荷）；絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖；絮凝剂的分子量；pH控制；搅拌速度和时间。,对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理，单独使用可达到较好絮凝效果；对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。,3、混凝,三、调整pH,pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。,细胞(碎片)及某些胶体物质在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。大幅度改变pH还能使蛋白质变性凝固。通过调整pH值改变膜过滤中易吸附分子的电荷性质，可减少膜堵塞和污染；影响离子型絮凝剂的电离度。,0,0,200,400,600,6,12,18,pH4.6,pH4.2,pH3.8,pH2.8,FiltrateVolume,cm,3,Time,minutes,FigTheeffectonfiltratevolumeofpH,四、去除杂质不溶性多糖,不溶性多糖(淀粉)会增大原料液黏度。加淀粉酶可把淀粉水解为单糖(可溶)，达到去除的目的，同时降低了原料液黏度。,五、高价无机离子的去除方法,Ca2+草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀（注意回收草酸）；Mg2+三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；Fe3+黄血盐，普鲁士兰沉淀,高价无机离子影响离子交换层析提纯操作。,高价无机离子的去除方法,草酸镁的溶解度较大，故加入草酸不能除尽镁离子。要除去镁离子，可以加入三聚磷酸钠Na5P3O10，它和镁离子形成可溶性络合物：Na5P3O10Mg2+MgNa3P3O102Na+用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。要除去铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀:4Fe3+3K4Fe(CN)6Fe4Fe(CN)63+12K+,六、杂蛋白的去除,杂蛋白存在的害处：常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤效率。采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。,杂蛋白的去除方法,1、沉淀法precipitation2、变性法Denaturation3、吸附法adsorption,1.杂蛋白去除-沉淀法precipitation,A等电点沉淀法（isoelectricprecipitation）蛋白质的等电点大都在酸性范围内(pH4.05.5)，调节原料液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。,B.酸碱调节，使蛋白质与离子形成沉淀在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子形成沉淀，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐等；在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子形成沉淀，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等。,2.杂蛋白去除-变性Denaturation,蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性。变性蛋白质溶解度较小。加热，大幅度调节pH值，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。,不足之处：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。,蛋白质变性例子,链霉素生产中，采用调pH至酸性（pH3.0），加热至70，维持半个小时的方法来使蛋白变性，能使过滤速度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。柠檬酸发酵液，采用加热至80以上，使蛋白质变性凝固和降低发酵液粘度，从而大大提高了过滤速度。,3.杂蛋白去除-吸附法adsorption,加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3Fe(CN)62的胶状沉淀来吸附蛋白质，利用此法除蛋白质已取得很好的效果。在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。,七、杂质DNA的去除,杂质DNA也会引起悬浮液黏度增大。1、核酸酶水解2、超声波破碎3、层析技术：离子交换层析，亲和层析,八、原料液的脱色,1、活性碳脱色：吸附作用，吸附色素,2、离子交换树脂脱色：脱色同时，一般不吸附酶,3、化学反应脱色：Na2SO3、NaHSO3与色素反应，生成无色物质,4、沉淀吸附脱色：沉淀吸附色素,九、加入助滤剂和反应剂提高过滤效果,1.加入助滤剂（filteraids）,一种不可压缩的多孔微粒，在发酵液中加入固体助滤剂，则菌体可吸附于助滤剂微粒上，助滤剂就作为胶体粒子的载体，均匀地分布于滤饼层中，降低了滤饼的可压缩性，减小了过滤阻力。目前生物工业中常用的助滤剂是硅藻土，其次是珍珠岩粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纤维素、白土等。,助滤剂的选择,(1)粒度根据悬浮液中的颗粒和滤液的澄清度确定，一般颗粒较小的滤饼应采用细小的助滤剂。(2)助滤剂的品种应根据过滤介质选择助滤剂品种。使用粗目滤网时易泄漏，可选择石棉粉、纤维素；采用细目滤布时，可使用细硅藻土；(3)用量间歇操作时，过滤介质表面预涂助滤剂，其厚度应不小于2mm。连续过滤机中根据过滤速度确定。使用硅藻土时，通常细粒为500g/m3，中等粒度700g/m3,粗粒700-1000g/m3。,2.加入反应剂,加入某些不影响目标产物的反应剂，可消除发酵液中的一些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速度。1）加入反应剂与某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀,生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，又能使蛋白质凝固，过滤性能上升，沉淀本身可作为助滤剂.如在新生霉素发酵液中加入CaCl2和Na3PO4，生成Ca3(PO4)2沉淀。2）发酵液中含有不溶性多糖物质时，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。,发酵液的固液分离,发酵液