生物有效成分的制备

第12章生物有效成分的制备,本章内容如下,12.1概述12.2材料的选择与处理12.3确立测定方法12.4有效成分的提取12.5有效成分的浓缩12.6有效成分纯化方案确定12.7有效成分纯度和性质的分析12.8实际运用（用发表的论文讲述）,第一节：概述,一、生化物质:通常是指动物、植物和微生物进行新陈代谢时所产生的各种具有活性功能的一些化合物包括蛋白质（包括酶）、核酸和多糖等生命大分子物质，还有氨基酸、黄酮、维生素、单宁、生物碱、木质素等小分子物质。二、生物有效成分:是指欲从生物细胞中分离纯化出来的某一目的物质（主要研究生命大分子物质），其余部分则统称为杂质。,第一节：概述,三、生物有效成分制备的基本步骤：原料的选择和预处理(含原料的粉碎)提取纯化干燥及保存成品、制剂及改型,第一节：概述,四、生物有效成分制备要注意的几个问题：（1）生物材料的组成成分非常复杂（2）在生物材料中，有些化合物含量很低或极微，有的只有万分之几。近年来，用所谓“钓鱼法”进行提取,第一节：概述,四、生物有效成分制备要注意的几个问题：（3）许多生物活性物质，一旦离开了生物体内环境，很易变性及被破坏（4）生化分离制备过程几乎都在溶液中进行，各种温度、pH、时间、离子强度等参数，对溶液中各种组成的综合影响，常常难以确定。,一、材料的选择原则：（1）有效成分含量多（2）稳定性好（3）来源丰富（4）保持新鲜（5）提取工艺简单，有综合利用价值。,第二节：材料选择与处理,第二节：材料选择与处理材料选择,为提高其质量、产量和降低生产成本，原料选择时还要注意以下各项：（1）原料的种属（2）发育阶段（3）生物状态（4）来源部位,第二节：材料选择与处理,二、材料处理一般来说，选择到合适的材料后，应及时使用。否则所需的有效成分会部分甚至全部被破坏，从而影响得率。若不能立即使用，则需要采用低温、避光、干燥环境或加入稳定剂等条件中的一种或几种进行保存。,第二节：材料选择与处理-材料处理,1.动物脏器冰冻（鲜料保存）-10冰库（短期保存）或-70低温冻箱（数月不变质）贮存。干燥（粉末保存）a对一般的小组织进行处理b对于含耐高温有效成分材料的处理,脏器一般宜先进行脱脂操作。,第二节：材料选择与处理-材料处理,2.植物组织：A.枝、叶、根等营养器官a、使用鲜活材料用水洗净，立即使用，或在10小时内置-4-30冰箱中贮藏备用。b、若使用植物干粉时，可以在太阳光或烘箱中烘干，磨成干粉，贮于瓶中备用。B.植物种子则需泡胀或粉碎后才可使用。,注意温度的限定!,如果材料含较多油脂，要进行脱脂处理。如：大豆种子,第二节：材料选择与处理-材料处理,3.微生物微生物种类多、繁殖快、培养简单、诱变容易和不受季节影响，它已成为生物大分子制备的主要材料之一。（1）菌种有效成分在胞外时的处理（2）菌种有效成分在胞内时的处理,第二节：材料选择与处理-材料处理常用方法,细胞破碎方法：1、机械法：有研磨法、撞击法、高速捣碎法、高速匀浆法、高速珠磨法、超声波法,高速珠磨机,高速匀浆机,第二节：材料选择与处理-材料处理常用方法,细胞破碎方法：2、非机械法：（1）酶学破碎法：外加酶制剂、自溶法、抑制细胞壁合成。（2）物理破碎法：冻结-融化法、渗透压差法（3）化学破碎法：有机溶剂法、酸碱处理法、表面活性剂（SDS等）,第三节测定方法的确立,一般情况下常用的测定方法有：光谱法、电化学法、生物活性检测法、免疫分析法、生物传感器法。1.光谱法(确定样品的量要先作一个标准曲线。),此法所用的测定样品量较少，但常常产生比较高的吸光度值，使测定量比实际含量偏大。,第三节测定方法的确立光谱法,1吸收光谱法。（常用）定义：利用目的物质特定的吸收波长（波峰对应的波长）来测定其含量。（简单常用）可分为：a直接测定法.b比色法,此法操作方便、简单，仪器设备比较便宜。,第三节测定方法的确立光谱法,2荧光法（前提是待测定物质会产生荧光或经过处理产生荧光）定义：用荧光计测量荧光强度以确定物质含量的方法当分析物含量，用吸收光谱法不能检测时，可改用荧光分析法。此法的精确性、重复性和灵敏度比吸收光谱法要好。,第三节测定方法的确立光谱法,3浊度法定义：是通过测量透光量大小来对分散物质的浓度加以测定的方法极稀的悬浮液可以采用此法测定，即测定悬浮液在不被吸收的波长下表观的消光值。,第三节测定方法的确立,2.电化学法：有些反应过程会放出质子氢（H+），可用灵敏的pH计或NaOH溶液滴定等方法追踪其变化,从而计算出欲测物的含量或活力。如:葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化反应，可用NaOH溶液滴定氧化产物含量，再推算出葡萄糖氧化酶的活力。,第三节测定方法的确立,3.生物活性检测法激素类等物质在注入机体后，使机体发生相应的变化，并且两者之间有一定的相关性，利用这种性质，即可对生命活性物质进行检测。如：人绒毛膜促性腺激素（HGG）能使小鼠子宫迅速增殖，通过检测小鼠子宫变化，推算出HGG的生物活性。,第三节测定方法的确立,4.免疫分析法是利用抗原与抗体之间的特异反应，并结合放射性同位素标记或酶标记，就有关物质进行灵敏的定性和定量分析。5.生物传感器法用生物传感器中的敏感膜与待测溶液中的某一物质进行反应，即可通过显示器反映出有效成分的数量。,第四节有效成分的提取（重点）*,一抽提的定义:通常是指用适当的溶剂和方法，利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异，把原料中的有效成分分离出来的过程。（1）用冷溶剂从固体物质提取的过程可称为浸渍（2）用热溶剂则可称为浸提，也称浸煮可用稀酸、碱、缓冲液、蒸馏水、有机溶剂等溶液进行抽提。,第四节有效成分的提取（重点）*,二、提取生物有效成分的主要影响因子1、原料颗粒度2、溶剂种类、浓度3、温度4、时间5、pH值6、料液比,针对蛋白质还有氧化作用、金属离子、水解酶等影响因子。,二、提取生物有效成分的主要影响因子,1、原料颗粒度原料的颗粒大小会影响提取效率：（1）颗粒过大，使浸提剂不能与原料充分接触，导致萃取率降低。（2）颗粒过细，使整个浸提剂-原料体系的粘稠度增大，溶剂传质速度减小，导致萃取率降低。因此，针对不同原料与浸提剂要通过实验确定最优的原料颗粒度。,二、提取生物有效成分的主要影响因子,2、溶剂种类与溶剂浓度（1）溶剂选择依据a对有效成分溶解度大（相似相溶）b破坏作用小c对杂质不溶解或溶解度很小d来源广泛e价格低廉f操作安全。,二、提取生物有效成分的主要影响因子,2、溶剂种类与溶剂浓度（2）常用溶剂a.一般常用的无机溶剂是水（或蒸馏水），因为水很经济便宜，所以在抽提水溶性物质时，首先考虑用水抽提。b.常用的溶剂极性排序：石油醚苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇水乙酸,二、提取生物有效成分的主要影响因子,2、溶剂种类与溶剂浓度（3）溶剂种类与溶剂浓度确定依据(1)、(2)两步结果初步确定浸提剂的大致种类不同浸提剂种类的单因素实验选出最优的浸提剂。选取到合适的浸提剂后不同浸提剂浓度的单因素实验浸提剂的最优浓度。,例如：下表是不同乙醇浓度对的吸光度值影响,二、提取生物有效成分的主要影响因子,3.温度温度的作用:一是会影响提取率，二是会因温度不适而使有效分子失活变质。1一般认为蛋白质和酶制品在低温（0左右）时最稳定,二、提取生物有效成分的主要影响因子,3.温度3一般实验时，采用单因素试验来确定最佳提取温度。a查阅相关的文献资料了解其温度稳定性b查询相关资料了解提取该有效成分的最佳温度大致在哪个范围。c选择合适的温度梯度进行单因素实验，直至出现下图中结果，图中波峰所对应的温度即是最优提取温度。,二、提取生物有效成分的主要影响因子,4.时间抽提时间过长，容易造成有效成分失活量增多，且会带来人力、物力乱费。抽提时间过短，则有效成分获取率不高，乱费材料。同样，宜采用时间作单因素试验，获取最佳抽提时间。如；微波、超声波、超临界、回流萃取。,二、提取生物有效成分的主要影响因子,5.pH值对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般选择抽提液的pH值应在偏离等电点的范围内。通常碱性蛋白质低pH值（酸性），酸性蛋白质高pH（碱性）的溶液抽提同样可以采取单因素试验法确定最优pH值。,二、提取生物有效成分的主要影响因子,6.料液比（提取液与抽提物的比例,g/ml）抽提液过多，会造成溶剂乱费和人力，物力乱费抽提液过少，则抽提不完全，乱费原料。同样可以采取单因素试验法确定最优料液比,料液比实验结果图和前面几个因子的图形相似吗?,二、提取生物有效成分的主要影响因子,7.其他影响因子1氧化：一般蛋白质都含相当数量的巯基，易被氧化，导致酶（或蛋白质）失活变性2-羟基乙醇、或半胱氨酸、还原谷胱甘肽和巯基乙酸盐、等还原剂能阻止氧化作用（2）水解酶提取纯化时，易受到本身酶的影响必要时加入酶抑制剂或调节抽取液pH值与离子浓度来抑制分解酶活性,第五节有效成分的浓缩*（重点）,由于抽提液体积较大，一般必须先进行浓缩处理，再进行纯化和鉴定。一、沉淀法：（1）盐析法（2）等电点法（3）非离子型聚合物沉淀法（4）聚电解质沉淀法（5）高价金属离子沉淀法（6）有机溶剂沉淀法（7）选择性沉淀法（8）无机盐沉淀法（9）有机盐沉淀法(10)亲和沉淀法,第五节有效成分的浓缩*,二、吸附法：(1)活性炭(2)硅胶：吸附层析广泛使用。(3)有机高分子吸附剂大网格聚合物类吸附剂常用于抗生素和维生素B12分离浓缩。(4)多孔凝胶多孔性纤维素、琼脂糖凝胶用于生物大分子层析纯化(5)活性白土：脱组胺类过敏物，脱色。(6)硅藻土：助滤，澄清另外，无机吸附剂还有高岭土、氧化铝等,第五节有效成分的浓缩*,三、膜分离法：半透膜作用原理超过滤法(0.001-0.02um)、透析法、微滤(0.02-10um)、纳滤(1-7nm)、反渗透(0.1-1nm)等膜分离浓缩手段,第五节有效成分的浓缩*,四、减压蒸馏浓缩法真空减压蒸馏浓缩效果更好，可以在较低温度下达到蒸发的目的另外真空干燥仪、旋转蒸发仪、冷冻干燥仪等都是采用到真空干燥来浓缩的。,第六节有效成分纯化方案确定,一、纯化方案的设计原则：（1）粗放（2）快速（3）有利于缩小样品体积（4）工序处理简化,第六节有效成分纯化方案确定,二、纯化方案的评定：1、大分子蛋白质指标：（1）比活力=活力单位数/毫克蛋白