第十二章-色谱分析法PPT课件

.,1,概述,气相色谱理论基础,气相色谱法,色谱分离方法的选择,高效液相色谱法,.,2,1、色谱法的产生色谱法是一种分离技术，它是俄国植物学家茨维特1906年创立的。分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（CaCO3有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。色素受两种作用力影响,一、色谱分析法简介,12(1)-1概述,.,3,（1）一种是CaCO3吸附，使色素在柱中停滞下来（2）一种是被石油醚溶解，使色素向下移动各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。,.,4,Tsweet的实验,.,5,12-1概述,.,6,12-1概述,色谱法中共使用两相固定相固定不动的相CaCO3流动相推动混合物流动的液体石油醚色谱法：混合物在流动相的携带下通过色谱柱分离出几种组分的方法。流动相,液体流的速度慢，加压，使其流快，1969年HPLC发展，高压液相色谱。,气体1952年产生气相色谱，是色谱法一项革命性进展。,.,7,12-1概述,固定相：（1）固体吸附剂：CaCO3、Al2O3等（2）液体固定相（载体+固定液高沸点有机化合物，涂在载体上）色谱分离法一定是先分离。后分析一定具有两相；固定相和流动相分离：利用组分在两相中分配系数或吸附能力的差异进行分离,.,8,随着被分离样品种类的增多，该方法广泛地用于无色物质的分离，“色谱”名称中的“色”失去了原有的意义，但“色谱”这一名称沿用至今。,.,9,我国情况,我国在色谱分析领域的研究起于1954年，由中国科学院大连化学物理研究所首先开发。经过几十年的努力，我国色谱基础理论研究和应用技术研究方面具有特色，居世界领先行列。,.,10,12-1概述,4、特点：（1）分离效能高（2）灵敏度高（3）分析速度快（4）应用范围广,.,11,二、色谱分析法分类,1、按两相状态分类气相色谱气体作流动相（1）气固色谱：气体作流动相，固体吸附剂作固定相。（2）气液色谱：气体作流动相，固定液作固定相。,.,12,液相色谱液体作流动相（1）液固色谱：液体作流动相，固体吸附剂作固体相。（2）液液色谱：液体作流动相，固定液作固定相。超临界液体色谱超临界流体作色谱流动相。,.,13,2、按操作形式分类（1）柱色谱：填充柱色谱固定相填充到柱管内毛细管柱色谱把固定相涂在毛细管内壁上，中间是空的。（2）纸色谱：滤纸为固定相的色谱法，流动相是含一定比例水的有机溶剂，样品在滤纸上展开进行分离。（3）薄层色谱：把固体固定相压成或涂成薄膜的色谱法。,二、色谱分析法分类,.,14,3、按分离原理分类（1）吸附色谱：利用吸附剂表面对被分离的各组分吸附能力不同进行分离。（2）分配色谱：利用不同组分在两相分配系数或溶解度不同进行分离。（3）离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行分离。（4）凝胶色谱：利用凝胶对分子的大小和形状不同的组分所产生的阻碍作用不同而进行分离的色谱法。,二、色谱分析法分类,.,15,12(1)-2色谱图及色谱常用术语,一、色谱图混合物样品（A+B）色谱柱中分离检测器记录下来。组分从色谱柱流出时，各个组分在检测器上所产生的信号随时间变化，所形成的曲线叫色谱图。记录了各个组分流出色谱柱的情况，又叫色谱流出曲线,.,16,二、色谱图中的基本术语,.,17,1、基线在实验操作条件下，色谱柱后没有组分流出的曲线叫基线。稳定情况下，一条直线。基线上下波动称为噪音。,二、色谱图中的基本术语,.,18,2、色谱峰的高度h（1）峰高h色谱峰最高点与基线之间的距离，可用mm,mV，mA表示。峰高低与组分浓度有关，峰越高越窄越好。,二、色谱图中的基本术语,.,19,3.色谱峰的宽度标准偏差峰高0.607倍处的色谱峰宽的一半。,二、色谱图中的基本术语,.,20,峰底宽Wb色谱峰两侧拐点所作切线在基线上的距离Wb=4半峰宽W1/2峰高一半处色谱峰的宽度W1/2=2.354Wb=4W1/2=0.589Wb,Wb,.,21,4.色谱峰面积A色谱峰与峰底所围的面积。对于对称的色谱峰A=1.065hW1/2对于非对称的色谱峰A=1.065h(W0.15+W0.85)/2,二、色谱图中的基本术语,.,22,5.色谱保留值定性的依据,组分在色谱柱中停留的数值，可用时间t和所消耗流动相的体积来表示。组分在固定相中溶解性能越好，或固定相的吸附性越强，在柱中滞留的时间越长，消耗的流动相体积越大，固定相、流动相固定，条件一定时，组分的保留值是个定值。,二、色谱图中的基本术语,.,23,（1）死时间t0不被固定相吸附或溶解的组分流经色谱柱所需的时间。从进样开始到柱后出现峰最大值所需的时间。气相色谱惰性气体（空气、甲烷等）流出色谱柱所需的时间。,5.色谱保留值定性的依据,t0,.,24,(2)保留时间tR组分流经色谱柱时所需时间。进样开始到柱后出现最大值时所需的时间。操作条件不变时，一种组分有一个tR定值，定性参数。,.,25,（3）调整保留时间tR扣除了死时间的保留时间。tR=tR-t0又称校正保留时间，实际保留时间。tR体现的是组分在柱中被吸附或溶解的时间。,二、色谱图中的基本术语,tR,.,26,保留值用体积表示：（4）死体积V0不被固定相滞留的组分流经色谱柱所消耗的流动相体积称死体积，色谱柱中载气所占的体积。V0=t0F0柱后出口处流动相的体积流速mL/min,.,27,（5）保留体积VR组分从进样开始到色谱柱后出现最大值时所需流动相体积，组分通过色谱柱时所需流动相体积VR=tRF0（6）调整保留体积VR扣除了死体积的保留体积，真实的将待测组分从固定相中携带出柱子所需的流动相体积。VR=tRF0,二、色谱图中的基本术语,V0、t0与被测组分无关，因而VR.tR更合理地反映了物质在柱中的保留情况。,.,28,（7）相对保留值2，1或i,s在相同操作条件下，组分2或组分i对另一参比组分1或s调整保留值之比,二、色谱图中的基本术语,.,29,概念、表示方法及计算公式汇总,表-1,.,30,色谱曲线的意义：色谱峰数=样品中单组份的最少个数；色谱保留值定性依据；色谱峰高或面积定量依据；色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。,.,31,三、分配平衡,在一定温度下，组分在流动相和固定相之间所达到的平衡叫分配平衡，组分在两相中的分配行为常采用分配系数K和分配比k来表示。,K随T变化，与固定相、流动相的体积无关,1、分配系数K(浓度分配系数),.,32,2、分配比k(又叫容量因子，容量比),组分在固定相中的质量组分在流动相中的质量=ms/mm=svs/mvm=Kvs/vm,k=,k=tR/t0=(tR-t0)/t0k=VR/V0=(VR-V0)/V0,经推导得k与tR之间的关系：,k随T、固定相、流动相的体积变化而变化k越大，组分在固定相中质量越多，tR越长K、k越大，组分在固定相中tR就越长,.,33,总结：,（1）色谱峰的位置即保留值进行定性分析。（2）色谱峰的h.A进行定量分析。（3）色谱峰的位置及峰的宽度可评价色谱柱效的高度。,.,34,12(1)-3色谱法的基本理论,一、塔板理论,在50年代，色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论塔板理论用于色谱分析法。,.,35,塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n个塔板，每个塔板高度称为理论塔板高度，用H表示，在每个塔板内，试样各组分在两相中分配并达到平衡，最后，挥发度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。尽管这个理论并不完全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。,一、塔板理论,.,36,一、塔板理论,对一个色谱柱来说，若色谱柱长度固定L，每一个塔板高度H越小，塔板数目越多，分离的效果越好，柱效越高。塔板数用n表示。n=L/H或H=L/nH越小，n越多，分离效果越好，用H,n评价柱效。由塔板理论导出n与Wb，W1/2的关系。*n=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2,.,37,有时n大，分离效果也不好，因用tR内含tm，后来改用有效塔板数。,一、塔板理论,n有效=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2H有效n有效,塔板理论的成功之处，提出了计算理论塔板高度、塔板数的公式及评价柱效的方法，具有开创性，但有一定局限性。,n理=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2H理n理,.,38,前面已知，用塔板理论来说明色谱柱内各组分的分离过程并不合理，因为色谱柱内并没有塔板。当同一试样进入同一色谱柱，当流动相速度变化时，得到不同的色谱图。测得的n和H也不同，充分说明塔板理论不足以说明色谱柱的分离过程。,、速率理论范第姆特方程,.,39,1956年，荷兰学者范第姆特（VanDeomter）提出一个描述色谱柱分离过程中复杂因素使色谱峰变宽而致柱效降低（即：使H增大）影响的方程。此方程经简化后写为:,该式称为速率方程（范氏方程）。下面我们将对公式中的各项进行讨论,u为流动相线速度cm.s-1，线速度=柱长/死时间,、速率理论范第姆特方程,.,40,、速率理论范第姆特方程,（1）提出了影响的三项因素：涡流扩散项，分子扩散项，传质阻力项。（2）在流动相流速一定时，当、最小时，才小，n才最高，柱效高。当、最大时，才大，n才最小，柱效低。,.,41,（1）涡流扩散项A,在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散。,.,42,A2dpA与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子有关。减小：固定相颗粒应适当细小、均匀填充要均匀。,（1）涡流扩散项A,.,43,待测组分是以“塞子”的形式被流动相带入色谱柱的，在“塞子”前后存在浓度梯度，由浓稀方向扩散，产生了纵向扩散，使色谱峰展宽。,（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）,.,44,B2D是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相的几何形状对分子扩散的阻碍情况。D为组分在流动相中扩散系数（cm2s-1）。Dg气相扩散系数比液相扩散系数Dm大的多（约105倍）,（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）,.,45,减小纵向扩散项u采取措施：适当提高流动相流速u，减小保留时间用相对分子质量较大的气体作流动相。DgB2Dg适当降低柱温c.,（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）,.,46,（3）传质阻力项Cu,传质阻力系数包括两部分，m+Cs两项组成Cm流动相传质阻力系数组分从流动相移动到固定相表面进行两相之间的质量交换时所受到的阻力，质量交换慢，引起色谱峰变宽。,m,.,47,Cs固定项传质阻力系数即组分从两相界面移动到固定相内部，达分配平衡后，又返回到两相界面，在这过程中所受到的阻力为固定相传质阻力。,（3）传质阻力项Cu,2,组分在固定相中扩散系数,固定液膜厚度,.,48,减小采取措施：采用粒度小的填充物Cmdp2相对分子质量小的载气，Dg大。Cm1/Dg降低固定液液膜厚度(Csdf2)并且液膜要均匀；若膜厚，扩散，费时；但不能太薄，否则包不住载体。Ds越大越好，增加柱温是提高Ds的方法之一。,（3）传质阻力项Cu,.,49,为提高柱效，小，应注意以下几点：）采用适当小而均匀的载体，柱填充应均匀。）固定液液膜薄而均匀，并且不宜流失。）载气流速小的时候，u是影响的主要因素，选r大的载气，；载气流速大的时候，Cu是影响的主要因素，选r小的载气，H2，Ne）采用适当的柱温。,气相色谱,.,50,液相色谱,.,51,H,u,GC（a）,LC（b）,GC（a）u有一最低点u最佳；u小或u大，H都大LC（b）u没有最低点；u大，H增大不多，因此可用较高的流速，提高分析速度,.,52,可测三种流速对应的板高H，解三元一次方程，求出A、B、C即可求出u最佳和H最小。实际工作中，为缩小分析时间，可选略高u最佳的流速，常用u最佳。,GC中最佳流速可通过实验和计算方法求得将微分后得到,.,53,二、色谱基本分离方程,、分离度色谱柱的总分离效能指标定义：相邻两个峰的保留值之差与两峰宽度平均值之比,式中：分子反映了溶质在两相中分配行为对分离的影响，是色谱分离的热力学因素。分母反映了动态过程溶质区带的扩宽对分离的影响，是色谱分离的动力学因素。从中得到：两溶质保留时间相差越大，色谱峰越窄，分离越好。,.,54,两个峰tR相差越大，W越窄，值越大，说明柱分离较能高。.5两个组分能完全分开。.0两组分能分开，满足分析要求。.0两峰有部分重叠。,.,55,.,56,、分离度与柱效能，选择性的关系,柱效能指色谱柱在分离过程中的分离效能，常用n，来描述，n越大，越小，柱效越高，对单个组分而言。对多个组分的分离来说，无法用n,H来描述，n大，小，几个峰未必分的开。,选择性描述两个相邻组分在同一固定相中热力学分布行为的重要参数，用r2,1相对保留值表示.r2,1越大，保留时间相差大，分离越好（但未考虑峰宽因素）,.,57,、分离度与柱效能，选择性的关系,.,58,n=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2,、分离度与柱效能，选择性的关系,.,59,a:柱效项：塔板数决定，n越大，柱效越高分离的越好。,、分离度与柱效能，选择性的关系,b：选择性项：r2,1越大，tR（）与tR（1）相差越大，分的越好。,C：柱容量项：k大一些对分析有利;太大，tR长，柱容量合适,分的才好。一般k,.,60,以n有效表示，则有：,.,61,例题：,在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R=1.5。计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1cm，柱长是多少？解：r21=100/85=1.18n有效=16R2r21/(r211)2=161.52(1.18/0.18)2=1547（块）L有效=n有效H有效=15470.1=155cm即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全分离。,.,62,124色谱定性和定量分析,一、定性分析定性分析的任务是确定色谱图上各个峰代表什么物质。1.利用保留值与已知物对照定性（1）利用保留时间定性在相同色谱条件下，将标准物和样品分别进样，两者保留值相同，可能为同一物质。此方法要求操作条件稳定、一致，必须严格控制操作条件，尤其是流速。,.,63,.,64,（2）利用峰高增量定性,若样品复杂，流出峰距离太近，或操作条件不易控制，可将已知物加到样品中，混合进样，若被测组分峰高增加了，则可能含该已知物。（3）利用双色谱系统定性通过改变色谱条件来改变分离选择性，使不同物质显示不同保留值。例：选用极性差别较大的两种不同固定液来制备色谱柱，不同物质具有不同保留值,.,65,2.与其它分析仪器联用的定性方法,小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS）色谱-红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定,.,66,二、定量分析,气相色谱定量分析是根据检测器对溶质产生的响应信号与溶质的量成正比的原理，通过色谱图上的峰面积或峰高，计算样品中溶质的含量。,mi=fiAimi=fihimi被测组分i的质量，fi比例系数Ai、hi被测组分的峰面积及峰高,A=1.065hW12A=1.065h（W0.15W0.85）/2,.,67,1、定量校正因子,色谱定量分析是基于峰面积与组分的量成正比关系。但由于同一检测器对不同物质具有不同的响应值，即不同物质检测器的灵敏度不同，相同的峰面积并不意味着有相等的量。定量校正因子：单位峰面积对应组分的质量。fi=mi/Aifi绝对校正因子,(1)绝对校正因子绝对校正因子受操作条件影响较大，要严格控制色谱条件，不易准确测定，没有统一标准，无法直接引用，定量分析中采用相对较正因子。,.,68,（2）相对校正因子,用一个标准，把所有组分的A较正到标准物的A上，在同一标准上进行比较计算，热导检测器常用苯作标准。相对定量校正因子fi定义：样品中各组分的定量校正因子与标准物的定量校正因子之比。,fi(m)表示相对质量校正因子,.,69,也可用相对摩尔校正因子fi(M),（2）相对校正因子,凡文献查得的校正因子都是指相对校正因子，可用fM,fm分别表示摩尔校正因子和质量校正因子,.,70,2、定量方法,（1）归一化法试样各组分都出峰，可用归一化法定量。把所有出峰组分的含量之和当作100%的定量分析方法称为归一化法。若样品中有几个组分，每个组分的量分解为m1m2mn各组分含量总和为m，则组分的质量为mi,质量分数Wi为,.,71,（1）归一化法,优点：简便、准确、不需标准物，不必准确称量和准确进样，操作条件稍有变化对结果影响较少。缺点：所有组分都出峰，并测所有组分的A和fi,.,72,（2）内标法,准称样品m（含mi被测组分）+准称纯物质作内标物ms,混合物进样,被测组分,标样（内标物）,.,73,（2）内标法,s,s,i,i,s,i,A,f,A,f,m,m,=,s,s,i,i,s,i,A,f,A,f,m,m,=,.,74,对内标物的要求：1）内标物应是样品中不存在的纯物质。2）内标物与被测物的峰尽量靠近，但又能完全分开，tR相差少。为简便起见，求定量校正因子时，常以内标物本身作标准。fs=1.0优点：定量准确，操作条件不必严格控制，与进样量无关，被测组分和内标物出峰即可，适用于微量组分的测定，应用广泛。缺点：每次测定都要准确称量样品和内标物。,（2）内标法,.,75,（3）外标法标准曲线法,当样品中各组分不能完全流出，又没有合适内标时，可采用此法。将待测组分的纯物质配制不同浓度的标准系列，在相同操作条件下，定量进样，测各个峰的A或h，绘制AC曲线或hC曲线。,.,76,在完全相同条件下，测待测样品，根据A待或h待，从曲线上查出待测组分含量。优点：操作简单，计算方便，不用fi。缺点：要求准确进样，操作条件稳定。,（3）外标法标准曲线法,A(h),C,A待,C待,.,77,例题,已知物质A和B在一根30.00cm长的柱上的保留时间分别为16.40min和17.63min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30min。峰底宽度分别为1.11min和1.21min，计算：（1）柱的分离度；（2）柱的平均塔板数；,.,78,题解,（2）柱的平均塔板数n=16(16.40/1.11)2=3493n=16(17.63/1.21)2=3397n平均=（3493+3397）/2=3445,解：（1）柱的分离度,.,79,作业,P24010，12，14，17，18，19，20,.,80,2.色谱法的发展,随着被分离样品种类的增多，该方法广泛地用于无色物质的分离，“色谱”名称中的“色”失去了原有的意义，但“色谱”这一名称沿用至今。,.,81,2.色谱法的发展,1930年代初：R.Kuhn把M.Tswett的方法用于