细胞培养的生长测定

组织和细胞培养技术,细胞培养的生长测定,细胞培养的生长测定是指对细胞活力和细胞增殖的测定1.细胞计数法2.台盼蓝染色法3.MTT比色法4.细胞生长曲线法5.3H-TdR掺入法6.Brdu掺入法,一、细胞计数法,细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞密度。【材料】1.消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液2.细胞培养液3.血细胞计数板和盖玻片,【操作程序】处理贴壁生长细胞时，吸出培养液，加入消化液，在37条件下消化1-2min。待细胞变圆并将脱壁时，加入一定量的培养液，用吸管冲洗细胞，制成细胞悬液。对于悬浮培养的细胞，可直接制成细胞悬液。将盖玻片放在血细胞计数板的2个小室上。用毛细吸管或装有注射针的1ml注射器吸取少量细胞悬液，然后将细胞悬液轻轻注入盖玻片边缘与计数板交界处。通过盖玻片和计数板之间的毛细管虹吸作用，细胞悬液进入小室，并充满盖玻片和计数板的间隙。,3.在显微镜100倍放大倍数下用计数器计数四角大方格中的细胞数，即每个小室的中央方格和四角的方格。将压左边中线和上边中线的细胞计数在内，不计数压在右边中线和下边中线的细胞。,4.计数结束后，分别用双蒸水和70%酒精清洗细胞计数板和盖玻片，然后用擦镜纸擦干。,结果分析,细胞密度（个/ml）=平均细胞数104稀释倍数。细胞总数（个）=细胞密度细胞悬液量,注意事项,如果被计数的细胞不再使用，在消化后不需要加入培养液。在显微镜下观察细胞消化程度，以估计取细胞时间。消化时间过短时，部分细胞仍牢固贴壁，故取得的细胞较少，从而影响细胞计数。消化时间过长时，细胞受损，活性减弱。将细胞悬液充分混匀，以免计数结果出现偏差。向盖玻片和计数板之间注入细胞悬液时，以盖玻片下的间隙刚被充满为准。不满或过满都影响实验结果。每个大方格中的细胞密度以20-50个为宜。如果细胞密度太大，稀释后再次计数，以便提高细胞计数的精确度和速度。,二、台盼蓝染色法,在原代细胞的分离、传代、冻存和复苏等过程中，均可导致细胞的死亡。台盼蓝染色法用于检测存活细胞数。【材料】消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液。培养液或HBSS。0.4%台盼蓝溶液，用PBS配制。细胞计数板和盖玻片。,【操作程序】处理贴壁生长细胞时，吸出培养液，加入消化液，在37条件下消化1-2min。待细胞变圆并将脱壁时，加入一定量的培养液或HBBS，用吸管冲洗细胞，制成细胞悬液。对于悬浮培养的细胞，可直接制成细胞悬液。取0.5ml台盼蓝溶液，0.3mlHBBS和0.2ml细胞悬液，充分混匀。然后，将混合液放置1-2min。用毛细吸管或装有注射针的1ml注射器吸取少量细胞悬液注入盖玻片边缘与计数板交界处。至少计数500个细胞，并计数其中着色细胞。4.计数结束后，分别用双蒸水和70%酒精清洗细胞计数板和盖玻片，然后用擦镜纸擦干。,【结果分析】正常细胞不被着色。细胞死亡后，细胞膜通透性增加，台盼蓝进入细胞内，故细胞呈蓝色。细胞活力（%）=（细胞总数-着色细胞数）/细胞总数100%,注意事项,如果含有台盼蓝的细胞悬液放置时间过长，正常细胞可摄取染料，从而影响染色结果。台盼蓝染色法是一种粗略的检测存活细胞的方法，不能准确的反映细胞活性的差异。因此，应使用MTT比色法或凋亡检测法评价细胞活性或检测早期凋亡细胞。,三、MTT比色法,法建立于20世纪80年代初，是一种通过测定细胞能量代谢水平用以间接反映细胞增殖情况的检测方法。其原理是MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫蓝色的晶状甲瓒(Formazan)，将结晶的甲瓒溶解释放，再用酶联免疫检测仪测定吸光度OD值，OD值的高低可间接反映活细胞的数量及其活性。活细胞多则吸光度大，反之则吸光度小，从而反映出你的细胞的存活及增殖情况。,它基于两个假设：1、只有活细胞能够将MTT还原成为难溶性的蓝紫色结晶物，而死细胞不能达到；2、其吸光度与活细胞数量成直线正相关。,【材料】1、MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50mlPBS(0.01molL，pH7.2)，在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4避光保存。两周内有效。2、含10胎牛血清RPMl1640培养液、0.25胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)3、96孔培养板(单层生长的细胞选用平底型培养板，悬浮生长的细胞选用圆底型培养板)、可调移液器、吸管、离心管、计数板4、孵箱、显微镜、振荡混合仪、酶联免疫检测仪,【操作程序】1、接种细胞：用0.25胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMl604培养液配成单个细胞悬液，以每孔1001000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。2、培养细胞；将培养板移入CO2孵箱中，在37、5%CO2及湿度条件下，培养3-5天。3、呈色：培养第2-5天后，每孔加入MTT溶液(5mg/m1)20ul，37继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对浮生长的细胞，需离心,(1000rpm5min)，然后弃去孔内培养每孔加入150ulDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。4、比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线。,注意事项,1、选择适当的细胞接种浓度。由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测定其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证适时终止细胞培养。这样，才能保证MTT结晶形成量与细胞数呈的线性关系。2、避免血清干扰。用含15胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。因此，一般选小于l0胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。,3、设空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白孔。其它试验步骤保持一样。最后比色时，以空白孔调零。4、加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。5、如果用96孔板，周围一圈孔的值由于液体蒸发和温度梯度原因，存在明显的挥发现象，会误差很大，所以做的时候要求培养箱里的湿度条件控制的比较好,要不就需要弃取周围两轮孔的数据。6、MTT有毒性致突变性，操作时应注意防护。,【结果分析】细胞存活率=试验组OD/对照组OD100%,MTT主要优点：1、有灵敏度高，重复性好;2、操作简便、经济、快速、易自动化的优点;3、没有试验放射性污染;4、可以减少如细胞计数法、软琼脂克隆形成试验中的人为性因素。,四、细胞生长曲线法,原理：一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮后贴壁，随后度过长短不一的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期，在达到饱和密度后，细胞停止生长，进入平顶期，然后退化衰老。典型的生长曲线即可分为潜伏期、指数生长期、平顶期及退化衰老四个部分，其中的三个不同生长时相（潜伏期、指数生长期和平顶期）是每个细胞系所共有的特征。,意义：通过测定生长曲线，不仅可以了解培养细胞生物学特性的基本参数、测定细胞绝对生长数、判断细胞活力，而且也可用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。,【材料】24孔培养板。细胞悬液。消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液。培养液或HBSS。细胞计数板和盖玻片。,【操作程序】计算细胞密度2次，得出细胞密度平均值。然后，将细胞悬液等量加入培养板的每个孔中，培养时间计为0天。每隔24小时吸去3个孔的培养液，加入消化液，混悬细胞，计算细胞数目。每个孔计数2次，得出细胞密度平均值。连续7天，绘制细胞生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为细胞密度。,【结果分析】细胞生长曲线反映细胞的生物学特征。每一代细胞的生长过程可大致分为潜伏期、指数生长期和停滞期。潜伏期细胞对分离和传代操作所致损伤的恢复以及适应新生长环境的过程。一般来讲，原代细胞培养需要24-96小时，甚至更长时间才能恢复增殖。不同细胞的增殖恢复所需时间不同，传代细胞的潜伏期一般为6-24小时。指数生长期：细胞数量呈对数增长。指数生长期一般为3-5天。停滞期：细胞最后长满形成单层，不再增殖，生长停滞。,注意事项,培养板内各孔细胞的消化操作过程要一致，避免得出细胞密度有明显差异。细胞计数前，尽量使细胞混悬均匀。,五、3H-TdR掺入法,将用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到新合成的DNA中，通过测定3H放射性脉冲数比较不同细胞的增殖活性。【材料】1.仪器液闪计数器。2.标记物5uCimethyl-3H-TdR/ml,用培养液配制。3.清洗液PBS4.消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液。Ci=居里,【操作程序】将细胞悬液加入培养板，培养24-48小时。吸去培养液，加入含有3H-TdR的新鲜培养液，培养12-24小时。用PBS清洗细胞2次。消化和收集细胞。用预冷的10%三氯乙酸沉淀DNA,再用0.5ml1mol/LNaOH提取。然后，用0.5ml1mol/LHCL中和。用孔径为0.2微米滤器滤出DNA提取物，烘干。用液闪计数器测定每分钟放射性脉冲数。,【结果分析】被标记的细胞是处于分裂周期S期的细胞。掺入量反映DNA合成的快慢。,六、BrdU掺入法,【材料】仪器细胞计数器。标记物20umol/LBrdU,用培养液配成。清洗液PBS。PB液含100mmol/LKCH3COOH、30mmol/LKCL、10mmol/LNa2HPO4、1mmol/LMgCI2、1mmol/LNa2ATP和1mmol/LDTT。抗体稀释液含有0.5%BSA和0.1%Triton20的PBS。,【操作步骤】1.BrdU掺入（1）贴壁细胞1）培养皿中放一块盖玻片，然后加入细胞悬液，培养24-48小时。2）待细胞覆盖盖玻片约50%时，吸去培养液，加入含BrdU的培养液，继续培养15分钟。,（2）悬浮细胞1）将0.25g低凝点琼脂糖加入10mlPBS，加热至95，溶解后冷却至37。2）将1ml37琼脂糖溶液与4ml37的细胞悬液混合。3)加入10ml37石蜡，封好烧瓶，立即用手摇动10-15秒，呈现乳白色为止。4）在预冷的水中间歇地摇动烧瓶，冷却10分钟，使琼脂糖在石蜡中形成胶状。5）加入35ml预冷的PBS，混合后离心（1000r/min,5分钟）。然后吸去上清液，用PBS混悬琼脂糖包裹的细胞，再离心1次。6）用培养液混悬胶化细胞，培养1小时。7）吸去培养液，加入含BrdU的培养液，继续培养15分钟。,2.固定盖玻片上的细胞1)配制4%的甲醛：将4g低聚甲醛加入50ml蒸馏水中，加热至60，直到溶解。冷却后，加入50ml2PBS，用孔径为0.22um的滤器过滤。2）用PBS浸洗细胞2次，将盖玻片加入甲醛溶液，室温下放置10分钟。3）用PBS洗盖玻片2次后，再用0.2%Triton-100透化细胞5分钟。,3抗体标记盖玻片上的细胞1）用蒸馏水清洗盖玻片3次，然后用2mol/LHCL处理细胞1小时，使细胞变性。2）用0.1mol/LNa2B4O7中和变性的DNA，再用PBS清洗细胞2次。3）加入一抗，室温下放置1-2小时。4)用抗体稀释液浸洗3次，每次10分钟。5）加入二抗，室温下放置1-2小时。6）封片。,【结果分析】BrdU被掺入到DNA复制位点，这些复制位点可用荧光剂或者每偶联的抗体检测。计数染色细胞，得到有丝分裂指数。有丝分裂指数是指分裂象细胞占全部细胞的百分比。一般细胞的有丝分裂指数为0.1%-0.5%。细胞系和肿瘤细胞的指数较高，可达3%-5%。继代培养细胞的指数比原代细胞高。,【注意事项】BrdU是一种诱变剂，操作过程中应戴手套和护目镜，并在通风橱中进行。用Tris缓冲液稀释碱性磷酸酶标记的抗体。,细胞冻存与复苏,原理在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。,冻存就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。,冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。当细胞被冷至-5时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至-5-15之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会发生结冰；冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰；冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态（玻璃化冷冻）。,不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化，也可以对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较到冰晶，造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法。,不同细胞的最适冷冻速率不同。小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1.6/min、7/min和200/min。细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在1.6300/min，故对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。,冷冻保存温度,冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和功能。从实际和效益的观点出发，液氮温度（-196）是目前最佳的冷冻保存温度。在-196时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-196下均可保存十年以上。应用-70-80保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在冰点到-40范围内保存细胞的效果不佳。,复苏速率,复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。一般来说，复温速度越快越好。常规的做法是，在37水浴中，于1-2分钟内完成复苏。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。,冷冻保护剂,冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冷冻保护剂常常配制成一定的溶液。冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。,目前多以渗透性冷冻剂较为常用DMSO的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在4时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所以，冻存时DMSO平衡多在4下进行，一般需要4060分钟。,冷冻保存方法,按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70-80，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-100以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。但目前细胞冻存最常用的仍是前一种方法。,非玻璃化冻存方法,【材料】1.仪器设备：普通冰箱、低温冰箱和-70-80超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等；2.冻存管：容量为1ml或1.5ml；3.冷冻保护液：一般是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成。现配现用，或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴溶解；4.待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。,【操作程序】1.待冻存细胞悬液的制备(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；(2)将细胞悬液以8001000r/min离心5min，去上清夜；(3)向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达11061107个/ml；(4)按每管11.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；(5)再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。,2.分级冷冻先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（48），约40min；(2)接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-10-20），约3060min；(3)将冻存管转入低温冰箱（-40），放置30min左右；(4)然后将冻存管转移到超低温冰箱（-70-80），过夜；(5)最后将冻存管投入液氮保存。,3.记录做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。冻存结果如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。,玻璃化冻存方法,【材料】（1）冷冻保护液：为Hanks平衡盐溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr8000）而成。用2mol/LNaOH调节pH至7.4，现配现用。（2）冻存管：SILASTIC玻璃小管，内径3mm，外径4.5mm；（3）设备：液氮储存罐；（4）待冻存细胞,【冻存过程】（1）用常规方法分离全血中单核细胞；（2）在冰浴中预冷冷冻保护液；（3）将装有单核细胞的离心管放置入盛有冰水的烧杯内（冰浴）；（4）沿离心管壁缓慢滴加预冷的冷冻保护液。滴加过程为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加。2107个细胞要滴加15ml冻存液。滴加的时间在15min左右。最终细胞密度要在11061.5106个细胞/ml，边滴加边轻轻晃动离心管；,（5）轻轻吹吸混匀细胞冷冻悬液；（6）将细胞冷冻悬液分装于冻存管中。12cm长的冻存管装0.8ml细胞冷冻悬液；（7）将冻存管两端以火焰封口；（8）最后将冻存管直接投入液氮中保存。冻存结果如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。,非玻璃化冻存的复苏方法,主要材料（1）仪器设备：恒温水浴箱