2第二章-工业微生物育种学赤峰工业职业技术学院

抗代谢结构类似物突变株,与营养缺陷型等方法比较有如下优点：,1选育方法简单易行,只要能找到适当的结构类似物就很容易选育出结构类似物的抗性突变株。,主要氨基酸的结构类似物,2生产操作方便,营养缺陷型菌株发酵要求在培养基中添加营养物质来实现，并没有从根本上解除代谢调节，向发酵罐中补充营养物质的量不易控制，所以造成生产的不稳定。而结构类似物突变株的代谢调节被遗传性地解除，生产操作更方便，产量也更稳定。,3易于保存,抗结构类似物突变株易于保存，只要在保存的培养基中添加适量的结构类似物，就可防止回复突变的发生。,例：黄色短杆菌的抗苏氨酸、抗赖氨酸和抗异亮氨酸的结构类似物突变株的选育。,抗结构类似物的筛选方法,第一种方法：把结构类似物和培养基混合制成平板，把诱变后的菌体分离其上，培养一段时间后，解除反馈调节的突变株可以选择性地生长，在细胞内大量合成相对应的氨基酸，并分泌到培养基中，促使菌落周围敏感菌生长，形成一个混淆的增殖圈，挑取该菌落，进行复证。,抗结构类似物的筛选方法,第二种方法：浓度梯度法,例：浓度梯度法用于抗异烟肼的酵母菌吡哆醇高产菌株的筛选。,浓度梯度法已广泛应用于氨基酸、核苷酸、维生素、抗生素等高产菌株的选育，并且取得了良好的效果。,对浓度梯度法的评价,4累积前体和耐前体突变型的选育,前体物的加入对代谢终产物的合成有很大影响。特别是抗生素的前体物，对抗生素的产量的影响是直接的。,前体物对抗生素的影响,目的突变株,耐前体有关代谢物突变株的选育耐前体结构类似物突变株的选育耐“毒性”前体突变株的选育,耐前体有关代谢物突变株的选育,Kenichiro等发现添加异亮氨酸或天冬氨酸等可促进麦迪霉粟A1的生物合成，缬氨酸在低浓度时就能完全抑制麦迪霉素产生菌吸水链霉菌的（Streptomyceshygroscopicus）的生长。,耐前体结构类似物突变株的选育,初级代谢产物的结构类似物的突变株的应用已比较多，次级代谢产物的结构类似物突变株的应用却比较少。不过部分氨基酸是抗生素的前体，所以通过选育一些氨基酸的结构类似物突变株来提高抗生素的产量。,例：Elander选育耐5-氟色氨酸和6-氟色氨酸突变株出发菌株是荧光假单孢菌生产硝吡咯菌素,此外-内酰胺类抗生素和头孢菌素C等都是由氨基酸作为前体物合成的。,耐“毒性”前体突变株的选育,抗生素前体物一般有助于抗生素的生产，但当达到一定浓度时，前体物对菌株的生长有抑制作用，甚至是抑制终产物的合成。,例：灰黄霉素生物合成的前体物质是氯化物，但高浓度对菌体生长不利。,六、解除磷酸盐调节突变株的选育,磷酸盐是菌体生长的主要制约因素，也是不可或缺的营养成分。在培养基中，只要有磷酸盐存在，菌体就处于生长状态，因此它对次生代谢产物的合成是不利的。,磷酸盐对抗生素有明显的调节作用。已报道有32种抗生素的合成都受到磷酸盐的抑制或阻遏。发生阻遏的浓度一般在10mM以上。,然而过多地限制磷酸盐的量对菌体的生长不利，也会导致抗生素产量的下降。因此在抗生素的发酵生产中要将磷酸盐的浓度控制在“亚适量”的水平。,磷酸盐对次生产物的调节机制,1通过初级代谢的变化影响次级代谢；2能荷（ATP）的调节,通过初级代谢的变化影响次级代谢,1加强初级代谢，可推迟抗生素合成的开始,磷酸盐,磷酸盐是许多初级代谢反应酶的效应物，对DNA、RNA和蛋白质合成有促进作用，对糖的代谢、细胞呼吸、ATP浓度均有影响，有利于菌体生长，导致抗生素合成的延迟。,通过初级代谢的变化影响次级代谢,磷酸盐,2改变糖类分解代谢途径，导致某些抗生素合成受抑制,磷酸盐有利于糖酵解，从而降低了戊糖途径的活力，导致某些以戊糖途径为先导的抗生素合成受抑制，主要是四环素类的四环素、金霉素、土霉素等。,通过初级代谢的变化影响次级代谢,3限制抗生素合成的诱导物，导致抗生素合成减少,例如，色氨酸是麦角碱的诱导物，甲硫氨酸是头孢霉素和磷霉素的诱导物，而磷酸盐是色氨酸合成酶以及甲硫氨酸合成途径中某些酶的抑制剂。,磷酸盐,通过初级代谢的变化影响次级代谢,4抑制或阻遏磷酸脂酶类的合成，从而导致抗生素合成的减少,链霉素、新霉素、紫霉素等合成过程中，某些中间代谢物质需经磷酸化步骤，而终产物则需去掉磷酸基团，这个过程是由磷酸脂酶来负责的，而磷酸盐能抑制该酶的合成。,磷酸盐,能荷调节,磷酸盐可能通过调节细胞内的效应物CAMP、ATP等来控制抗生素的基因表达。,抗磷酸盐突变株的筛选方法,Martin对抗生素合成的磷酸盐控制机制研究得比较详细，并建立了一种直观的筛选磷酸盐抑制脱敏突变株的方法。,七、细胞膜透性突变株的选育,细胞膜是细胞与外界环境进行物质和信息和交流的屏障，也是整个细胞代谢控制的重要一环。如果细胞膜通透性较差，则细胞内代谢产物难以分泌到细胞外，终产物大量积累而引起反馈抑制。,细胞膜转运物质的方式有四种,单纯扩散促进扩散主动运输基团转位,影响细胞膜通透性的因素,例如：谷氨酸生产与膜透性有很大关系。其中影响膜透性的因子很多，主要有生物素、油酸、青霉素、甘油和表面活性剂等，又以生物素影响最显著。,作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成。脂肪酸和甘油又合成细胞壁的主要成分磷脂。因此过量的生物素间接地干扰了细胞膜磷脂合成使细胞膜透性变差，谷氨酸不能排出体外。,生物素作用机制,所以，在发酵的过程中，用过量的生物素，并添加脂肪酸类似物，或添加青霉素等方法，可明显影响细菌细胞膜和细胞壁的合成，改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地外渗到培养基中。,饱和脂肪酸酯类或饱和脂肪酸的添加都可以拮抗和抑制生物素合成脂肪酸，因此油酸合成减少，由油酸和甘油共同合成的磷脂也减少，导致细菌细胞膜构成不完全，具有较好的通透性，有利于谷氨酸分泌到发酵液中。,谷氨酸细胞膜渗透性突变株的筛选方法,1筛选抗维生素P（芦丁）的衍生物突变株；2筛选溶菌酶敏感突变株；3筛选温敏突变株。（见第七章）,1筛选抗维生素P（芦丁）的衍生物突变株,维生素P能增加细胞膜的透性，能抗高浓度维生素P的菌株就是细胞膜透性高的生活和生产能力都很强的菌株。可以采用浓度梯度法筛选。,2筛选溶菌酶敏感突变株,对溶菌酶敏感的菌株通常都是细胞膜和细胞壁通透性较大的菌株。筛选方法：可将不同浓度的溶菌酶加到培养基中，制成琼脂平板，诱变处理后培养并观察，在1mg/mL的平皿上不能形成菌落的，则有可能是渗透性敏感突变株。,八、其他抗性突变株的选育（略）,九、次生产物代谢障碍突变株的应用,次生产物代谢障碍突变株主要是抗生素代谢障碍突变株。由于酶的缺失或调节机制改变而不能合成其亲株所产生的抗生素的突变株。代谢可能发生在初级代谢阶段，也可能发生在次级代谢阶段。,次生产物代谢障碍会造成几中情况,1突变生成同系物新抗生素；2突变生成中间体新抗生素；3突变生成前体类似物新抗生素；4突变消除抗生素无益成分。,1突变生成同系物新抗生素,这是一种由结构基因突变引起的抗生素途径某一区段代谢障碍性改变，称为“区段突变”，它使抗生素结构上发生某些变化，导致同系物抗生素的合成。,金霉素第6位碳原子上的甲基是由蛋氨酸提供的，如果获得蛋氨酸的缺陷型，就会形成去甲基金霉素。6-去甲基金霉素的效应比四环素还高数倍。在血液中浓度高而持久。这一点对治疗疾病是有利的。,例1,四环素合成过程中也有甲基化作用，如果甲基化酶缺失，也便形成去甲基四环素。,例2,例3：柔毛霉素产生菌经诱变处理得到一株青灰色变种，产生14-羟基柔毛霉素，也叫阿霉素，代替了亲株产生的柔毛霉素，据认为这是突变产生的最成功的一例。,2突变生成中间体新抗生素,次生产物代谢障碍区段突变还可以导致次级代谢途径阻断，使中间产物累积，这种中间体抗生素往往是更有用的新抗或半合成抗生素的原料药。中间体抗生素在本质上仍然是亲株抗生素的同系物。,地中海诺卡氏菌能产生五种利福霉素的混合物，左面是最后的五步反应。如果做成缺陷型就可以积累利福霉素SV。利福霉素SV对制造临床使用的利福霉素及其他半合成利福霉素来说是更适合的底物，因而很重要。,中间体抗生素往往可以用来作为半合成抗生素的原料药，因而往往具有比亲株抗生素更高的使用价值。,值得注意的事,3突变生成前体类似物新抗生素,如果用生物“半合成”某个具有比较负责基因的抗生素的话，就要筛选到丧失了合成天然前体能力的突变株，这种突变株在加入有关前体时，可以产生所产生的抗生素。但若加入这一前体的结构类似物，就可能把这一类似物结合到抗生素分子中形成新的半合成抗生素。,这种植被新抗的技术是Brich于1963年提出来的，称其为“突变生物合成”或“突变合成”。Shier等人首先采用此法合成了新霉素的同系物杂霉素（Phbrimycins）。后来有氨基糖苷类、大环内酯类和-内酰胺类抗生素的相关研究。,紫苏霉素产生菌的突变生物合成是最典型的例证。,Testa等,前体类似物生物合成不仅是增加了产抗的途径，而且是定向寻找新的、高效低毒、抗