南京医科大学-现代实验技术概述

现代实验技术概述,南京医科大学儿科医学研究所辜楠,研究思路,整体（动物模型、ELISA）组织、细胞（组织、细胞培养）分子（RNA、DNA、Protein）基因（基因克隆）,整体研究,动物模型自发性动物模型（SpontaneousAnimalModels）是指实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下所发生的疾病。这类模型在遗传病、代谢病、免疫缺陷病、内分泌疾病和肿瘤等方面的应用正日益增多。诱发性或实验性动物模型（ExperimentalAnimalModels）是指研究者通过使用物理的、化学的和生物的致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身一定的损害，出现某些类似人类疾病时的功能、代谢或毒使动物患相应的传染病，又如用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤等。是药物筛选研究工作所首选。,整体研究,ELISA酶联免疫吸附测定（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）原理:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量呈一定的比例，由此进行定性或定量分析。,ELISA,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）（3）酶反应的底物。,ELISA,双抗体夹心法测抗原,双抗原夹心法测抗体,组织、细胞培养,培养：将取得的组织、细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。,组织、细胞培养,组织块培养：直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。细胞培养：一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。,培养条件,完全培养基：由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成。条件：37度、5CO2、合适的PH关键：无菌,CO2培养箱,免疫组织化学,基本原理用抗原和抗体特异性结合的原理和特殊的标记技术，对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的显色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电镜观察。免疫组织化学（Immunohistochemistry）技术在细胞、染色体或亚细胞水平原位检测抗原分子，是其它任何生物技术难以达到和代替的。它能在细胞、基因和分子水平同时原位显示基因及其表达产物，形成了新的检测系统，为生物学、医学和各个领域分子水平的研究与诊断，开拓了广阔的前景。,分子水平研究,转录翻译DNARNAProtein逆转录中心法则,核酸提取,分类：DNA主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNARNA存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等非细胞形式存在的病毒和噬菌体（或只含DNA，或只含有RNA）,核酸制备步骤,破碎细胞,提取,纯化,总RNA的提取,RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径：1)提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2)直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相关键的是抑制酶活性,TRIZOL法,TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。氯仿离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。异丙醇沉淀还原水样层中的RNA。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。,完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提,DNA的提取,从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。对于低等生物如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA分子量较小，提取时易保持其结构完整性。从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA分子量较大，一般达210道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核DNA外，还有质粒DNA等。,全血DNA的提取,原理：在全血或骨髓样本中分离DNA时，不含DNA的红细胞首先被裂解继而从白细胞中分离。在DNA稳定剂（抑制细胞内和环境中的DNase活性）存在时用一种离子去污剂即可从体液或微生物血细胞、动物组织细胞等细胞中分离DNA。RNA酶可去除RNA污染。其它污染物如蛋白质可通过盐沉淀来去除。乙醇沉淀并在含有DNA稳定剂的缓冲液中溶解从而得到基因组DNA。,蛋白质提取,基本步骤：清洗组织/细胞（缓冲盐液）裂解细胞（裂解液）离心去除膜组分等获得可溶性蛋白质纯化（离心、层析、电泳等）,电泳,概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。原理：在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。,聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。其分辨率比聚丙烯酰胺凝胶低，但制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点。用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高。聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，双向电泳等类型。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。3.在电场中形成不连续的电位梯度在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。,8.3,8.3,8.9,6.7,水平板式电泳槽,垂直板式电泳槽,反转录聚合酶链式反应（Reversetranscription-Polymerasechainreaction）抽提RNA总RNARTcDNAPCRDNAAnalysis:QuantificationorcDNAclone,RTPCR,RT逆转录,定义：以信使RNA（mRNA)为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成cDNA(基因)。逆转录酶(AMV、M-MLV)mRNAcDNA,PCR聚合酶链式反应,体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段。原理：类似于DNA的体内复制在试管中的DNA的体外合成。用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。,引物1,引物2,模板,PCR原理示意图,目的基因增加2n,2030循环,94变性,53,35,变性94,引物,退火45-65,延伸72,PCR过程示意图,模板,PCR反应产物积累规律示意图,平台期,产物量,时间（循环数）,PCR反应五要素,引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）,实时荧光定量PCR,常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析,淬灭基团,R,荧光定量PCR示意图,模板DNA,DNA探针,R,Q,Q,报告基团,WesternBlotting,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。,WesternBlotting,蛋白质分离：十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）蛋白质转印：蛋白质转移到硝酸纤维素膜（NC）上，称为一个印迹（blot）固相免疫测定(ECL)：一抗、酶标二抗、底物,NorthernBlotting,RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。应用：检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。,提取RNA,琼脂糖凝胶变性电泳,碱变性、转移到NC膜,与DNA或RNA探针杂交,放射自显影,Northern印迹杂交,NorthernBlotting,RNA分离：琼脂糖凝胶变性电泳（去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离）RNA转印：RNA转移到硝酸纤维素滤膜上探针杂交X光片进行放射自显影,pancreaskidneyskeletalliverlungplacentabrainheart,GEFmRNA,Northernblottinghybridization,基因克隆,基因克隆（分子克隆molecularcloning）应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。,基因克隆示意图,基本步骤,提取目的基因:人工基因合成法(RT-PCR)目的基因与载体结合:限制性内切酶、DNA连接酶将目的基因导入受体细胞:转化目的基因的检测和表达:,载体（Vector）：是指运载外源DNA有效进入受体细胞内