谷氨酸发酵及工艺流程

.,谷氨酸发酵,.,谷氨酸的简介,谷氨酸，是一种酸性氨基酸。分子内含两个羧基，化学名称为-氨基戊二酸。谷氨酸是里索逊1856年发现的，为无色晶体，有鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶液，等电点3.22。大量存在于谷类蛋白质中，动物脑中含量也较多。谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。,.,一、发酵前准备二、发酵阶段三、清洗仪器四、实验总结,谷氨酸发酵及工艺流程,.,一、发酵前准备,一级种的培养二级种的培养发酵培养基的配置试剂的配置仪器设备的准备,.,一级种的培养,菌种:谷氨酸产生菌BL-115培养基的配置：按下列培养基配方配1000ml一级种子培养基。按20%装液量分装后，于121灭菌30min冷却备用。葡萄糖2.5%、尿素0.5%、硫酸镁0.04%、磷酸氢二钾0.1%、玉米浆2.5-3.5%、磷酸亚铁、硫酸锰各20ppm、pH7.0一级种子培养：将斜面菌种接入已灭菌冷却的一级种子培养基中（250ml三角瓶内接入12环）于321、250r.p.m条件下培养12h。一级种子质量要求：种龄12h；pH6.40.1；光密度：净增O.D值0.5以上；无菌检查阴性，噬菌体检查无。,.,二级种的培养,菌种:一级种培养基的配置：按下列培养基配方配制1000ml二级种子培养基，并按20%装液量分装于三角瓶中后，于121灭菌30min冷却备用。葡萄糖2.5%、玉米浆2.5-3.5、K2HPO40.15%、MgSO40.04、尿素0.4%、FeSO42ppm、MnSO42PPm、pH6.87.0二级种子培养：在已灭菌的二级种子培养基中，按0.5-1.0%接入上述以培养好的一级种子，于321、250r.p.m条件下培养7-8h，二级种子质量要求：种龄7-8h、pH6.87.2、OD值净增0.5左右无菌检查：噬菌体无、残糖消耗1%左右镜检：生长旺盛，排列整齐，G+,.,发酵培养基的制备,发酵培养基：按下列培养基配方制发酵培养基，并按70%装液量装于小型发酵罐中，离位灭菌，121实罐灭菌20min，冷却备用。葡萄糖10%，玉米浆0.1-0.15%，Na2HPO40.17%，KCL0.12%，MgSO40.04%，用NaOH溶液调pH7.20于110灭菌20min冷却备用。流加试剂:将40%尿素溶液、1%水解糖液、4%水解糖液分别装入流加瓶中,12115min备用,.,试剂的制备甲液：称取15g硫酸铜与0.05g亚甲基蓝于1000mL容量瓶中，加蒸馏水定溶至刻度线处乙液：称取50g酒石酸钾钠，75g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾至1000mL容量瓶中，加蒸馏水定溶至刻度线革兰氏染色：结晶紫、碘液，95%乙醇、番红仪器准备仪器设备：摇床、显微镜、751型分光光度计、5L发酵罐、空压机、革兰氏染液、PH计、离心机、药物天平,.,二、发酵阶段,发酵生产操作:发酵液冷却至40左右时，通过蠕动泵加第一次尿素，添加量为0.81。0%。接种将前次实验制备的二级种子8-10%的接种量接入发酵罐。于351、250r.p.m条件下培养35h发酵过程的控制:温度控制pH控制糖液流加,.,温度控制,谷氨酸发夹012h为长菌期，最适温度在3032，发酵12小时后进入产酸期，控制3436。由于发酵期代谢活跃，发酵罐要注意冷却，防止温度过高引起发酵迟缓。,pH控制,发酵过程中产物的积累导致pH下降，而氮源的流加导致pH的升高，发酵中当pH值进行控制既8h前pH7.0-7.6；8h后pH7.2-7.3，,20-24h期间pH7.0-7.1,24-35h期间pH6.5-6.6.尿素流加总量为4%,糖液流加,从第10h开始每隔4h补糖一次，每次补入1%的水解糖液，在发酵26h前补入4%的水解糖液。,.,发酵过程中，需注意完成下列工作,注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在适合的范围内，遇有故障及时排除。每两小时取样一次，每次取样80ml，取样时，用量筒准确取流出的培养液80ml，对号倒入三角瓶中，封口，来不及测定的样液要立即放入冰箱保存每2小时记录发酵过程温度、pH、OD、通风、转速的测定数值，并记录操作情况。OD值测定方法：均匀取样5ml于编号试管中，用空白发酵液稀释至一定浓度，在722分光光度计上测定A600，根据菌体浓度与吸光度之间关系的标准曲线换算出菌体浓度；其余发酵于2000r/min条件下离心分离10min，上清夜入编号三角瓶，用于测糖还原糖测定：用菲林快速定糖法。菌体形态观察：革兰氏染色，油镜观察菌形、革兰氏染色结果以及有无杂菌污染,.,清洗仪器,放罐：到放罐标准后，及时放罐。经过发酵约35h后，后残糖在1%以下且糖耗缓慢或残糖0.5%，菌量增长（OD）值缓慢时，便可放罐，放罐操作同取样。排放液需灭菌处理才可进入下水道清洗：放罐后，将发酵罐清洗干净，关闭所有电源粗提：用浓硫酸将发酵液pH调至谷氨酸的等电点（pH3.15），用等电点法进行谷氨酸的粗提。,.,结果分析,样液OD值变化表,分析：OD值各组变化差距很大，据我所知是由于操作失误所致,.,茚三酮检测OD值变化情况表,分析：有个别组测的值很高，可能是操作问题所致，总体来说，谷氨酸检测的OD值偏低，不在0.20.8这一合理范围之内，失去意义,OD值,组别,.,本组镜检结果,第一阶段，视野中有少量菌体,第二阶段，镜片有污渍，无法观察,.,残糖测定浓度变化表,分析：总趋势是残糖浓度在下降，说明有菌体在代谢，但变化趋势不明显，说明菌体浓度不高,.,综合分析,1、本次实验的