第二章-色谱导论PPT课件

色谱导论,色谱概述及分类色谱分离过程和色谱图柱色谱法的定性定量分析方法,第一节概述及分类,一、色谱法的由来1906年由俄国植物学家Tsweet创立植物色素分离,固定相CaCO3颗粒流动相石油醚色谱柱：玻璃管,二色谱法的发展历史,A.J.P.MARTIN和R.L.M.Synge,A.J.P.MARTIN.(1910-2002)oftheBritishNationalInstituteforMedicalResearchsharedwithfellowcountrymanR.L.MSyngetheNobelPrizeinChemistry(1952)fortheinventionofpartitionchromatography.R.L.M.SyngebornOct.28,1914,Liverpool,Eng.diedAug.18,1994,Norwich,Norfolk.SyngestudiedatWinchesterCollege,Cambridge,andreceivedhisPh.D.atTrinityCollegetherein1941.,三色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作,四色谱法定义、实质和目的,定义：利用物质的物理化学性质建立的分离、分析方法实质：分离目的：定性分析或定量分析,五分类：1按两相分子的聚集状态分：,流动相固定相类型,2按固定相的外形分,3按分离原理分：,分配色谱：利用分配系数的不同吸附色谱：利用物理吸附性能的差异离子交换色谱：利用离子交换原理空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同,六色谱法的特点,优点：高选择性可将性质相似的组分分开高效能反复多次利用组分性质的差异产生很好的分离效果。高灵敏度10-1110-13g，适于痕量分析。分析速度快几十分钟完成一次分离，可测多种样品应用范围广气体，液体、固体物质，经化学衍生化后再色谱分离分析。缺点：对未知物分析的定性专属性差进一步分析需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS),第二节色谱分离过程和色谱图,一色谱过程：被分离组分在两相中的“分配”平衡过程,以分配色谱为例：进入固定相返回流动相再进入固定相再返回流动相反复多次分配被测组分分配系数不同差速迁移分离微小差异积累较大差异分配能力弱的组分先流出；分配能力强的组分后流出,二、色谱流出曲线和色谱峰,1流出曲线和色谱峰由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰2.基线色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线，S/N大、稳定的基线为水平直线3.峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示,4.保留值保留值是试样中各组分在色谱柱内滞留时间的数值，反映了组分分子与固定相分子间作用力的大小，是组分的色谱行为。(1)死时间tM不被固定相保留的组分（如空气、甲烷）进入色谱柱时，从进样到出现色谱峰极大值所需的时间称为死时间。死时间也是流动相流经色谱柱所需要的时间，流动相平均线速度可表示为：,(2)保留时间tR：试样组分从进样到柱后出现浓度最大值时的时间。保留时间就是组分通过色谱柱的时间，或者说组分在柱内运行的时间。,(3)调整保留时间：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即tR=tR-tM保留时间是色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关，流动相流速大，保留时间相应降低，两者的乘积仍为常数；而保留体积与流速无关，因此有时需用保留体积来表示保留值。,（4）死体积VM：不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流动相体积。它是指未被固定相占据的空隙体积，还包括色谱仪管路、连接头间空隙以及检测器间隙。死体积VM可由死时间与流动相流速(Fo与温度和气压有关)来计算：VM=tMFo,（5）保留体积VR：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。VR=tRFo（6）调整保留体积：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。VR=VR-VM=tRFo,死体积反映了色谱柱和仪器系统的几何特性，它与待测物的性质无关，故保留体积值中扣除死体积后将更加合理的反映被测组分的保留特性。保留值:试样的各组分在色谱柱中的滞留时间，通常用时间或用将组分带出色谱柱所需载气的体积表示。被分离组分在色谱柱中的滞留时间主要取决于它在两相间的分配过程，保留值是由色谱分离过程中的热力学因素所控制的，在一定的固定相和操作条件下，任何一种物质都有确定的保留值。,只要柱温，固定相性质不变，即使柱径，柱长，填充情况及流动相流速有所变化，保留体积和调整保留体积都不变。同一组份的保留时间与流速有关；保留体积VR和调整保留体积VR与流速无关。,5相对保留值r2,1,（1）组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比（2）表示固定相的选择性，等于1不能分离（3）相对保留值的优点是只要柱温，固定相性质不变，即使柱径，柱长，填充情况级流动相流速有所变化，相对保留值仍保持不变，因此它是色谱定性分析的重要参数,相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比,6选择因子,在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，以表示：,式中tr(i)为后出峰的调整保留时间，所以这时总是大于1的,7色谱峰区域宽度,色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：1.标准偏差即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半EF距离的一半2.半峰宽W1/2即峰高一半处对应的峰宽，GH间的距离W1/2=2.354,3.基线宽度W色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图IJ的距离它与标准偏差的关系是：W=4,色谱流出曲线得到的重要信息,(l)色谱峰的个数，判断样品中所含组份的最少个数。(2)根据色谱峰的保留值(或位置），进行定性分析。(3)根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析。(4)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。(5)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据。,三、色谱分析理论基础,两组分峰间距大小：由各组分在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的热力学性质决定。每个组分峰宽大小：由组分在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程动力学性质决定。研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行。,（一）分配过程的参数,1分配系数（平衡常数）在一定的压力和温度下，组分在两相间达到分配平衡时，组分在固定相中的浓度Cs与在流动相中的浓度Cm之比。,K与组分性质，固定相性质，流动相性质，温度和压力有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关；分配系数K越大，越晚流出色谱柱；分配系数K越小，越早流出色谱柱；组分在柱中移动速度与其分配系数成反比。,2分配比（容量因子，容量比）在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比，反映了组分在柱中的迁移速率。,k值决定于组分，两相热力学性质，随柱温、柱压变化而变化，还与流动相及固定相的体积有关，Vm为柱中流动相的体积，色谱柱固定相颗粒间的空隙体积，Vs为柱中固定相的体积。,3分配系数K与分配比k的关系,（1）称为相比率，它是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱，=635；对毛细管柱，=601500。（2）分配系数K只决定于组分和两相性质，与两相体积无关；分配比k不仅取决于组分和两相的性质，且与相比率有关，即组分的分配比随固定相的量而改变。（3）二者在表征组分的分离行为时是完全等效的。,4、保留值与分配比k的关系,k=VR/VM=tR/tM,分配比是调整保留时间（体积）与死时间（体积）之比，表示组分在固定相中的时间比在流动相中长多少倍；也说明调整保留值与分配比成正比。,5、分配系数K及分配比k与选择因子的关系,K或k反映的是某一组分在两相间的分配情况；而是反映两组分间的分离情况！当两组分K或k相同时，=1时，两组分不能分开；当两组分K或k相差越大时，越大，分离得越好。两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。,二塔板理论,最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数(n)作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等水平的塔板组成。每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度。,塔板理论假设：1.在柱内任一塔板内，组分在两相间瞬间达成平衡，这一小段柱长称为理论塔板高度H。2.以气相色谱为例：载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）。3.所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。4.分配系数在所有塔板上均是常数，与组分在某一塔板上的量无关。,可以理解为：每一块塔板上，被分离组分在两相间快速形成分配平衡，而随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：n=L/H。n称为理论塔板数,与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随塔板高度H的增大而减小。,为简化起见，假设色谱柱由5块塔板（n5）组成，以r表示塔板编号，0,1，2；某组分的分配比k=1。在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，故p=q=0.5。以此类推。每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(见下表)。,塔板理论得出：第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n大于50时，可得到基本对称的峰形曲线。通常填充色谱柱的n约为103106，H1mm。而毛细管柱n=105-106，H0.5mm。第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过多次的分配平衡后，可获得良好的分离。第三，n与半峰宽及峰底宽的关系式为：n=5.54(tr/W1/2)2=16(tr/W)2,若扣除死时间tM，用有效塔板数n有效表示柱效:n有效=5.54(tr/W1/2)2=16(tr/W)2色谱峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高，因此，n和H是描述柱效能的指标。,特点：塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，还提出了计算和评价柱效的参数。不足：谱带会为什么扩张？影响柱效的因素以及提高柱效的途径？载气流速对柱效有没有影响?,塔板理论的特点和不足,三、速率理论,1956年，荷兰学者VanDeemter提出了色谱过程动力学速率理论。吸收了塔板理论的概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，给出了VanDeemter方程：H=A+B/u+Cuu为流动相的线速度；A、涡流扩散项；B、分子扩散项系数、C、传质阻力项系数。,1涡流扩散项(A),在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性：同一组分运行路线长短不同流出时间不同（形成一个统计分布）峰形展宽。,A=2dpdp填充物平均直径；填充不规则因子A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子有关，与流动相的性质、线速和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此A0,2分子扩散项(B/u)纵向分子扩散是由于色谱柱轴向上的浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈“塞子”状分布。随着流动相的推进，“塞子”因浓度梯度而向“塞子”前后自发地扩散，组分分子从高浓度处向低浓度处扩散，引起谱峰展宽。,B2Dg：弯曲因子，填充柱色谱，1.5，R增加不大)。改变的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。,3)分离度R与分配比k的关系,k与两组分的性质和柱子都有关。k增加，分离度R增加，但当k10，则R的增加不明显。通常k在210之间改变k的方法有：适当增加柱温(GC)、改变流动相性质和组成(LC)以及固定相含量,例：两组分在1m长柱子上的分离度为0.75，问使用多长柱子可以使它们完全分离？,解：,例：已知物质A和B在一根30.0cm长的柱上的保留时间分别为16.40和17.63min，不被保留组分通过该柱的时间为1.30min，峰底宽为1.11和1.21min，试计算（1）柱的分离度（2）柱的平均塔板数（3）塔板高度（4）达1.5分离所需柱长,解：,第三节色谱法的定性定量方法,一定性分析1、利用保留值定性1）已知对照物定性：定性专属性差不同组分如在某一色谱条件下保留值相同，应更改色谱柱再检测，粗步判断是否为一个纯物质。2）相对保留值定性在样品和标准中分别加入同一种基准物s，将样品的ri,s和标准物的ri,s相比较来确定样品中是否含有i组分。,3利用保留指数定性,保留指数是把物质的保留行为用两个紧靠它的标准物（一般是两个正构烷烃）来标定，设正构烷烃的保留指数为碳数100；测定时，将碳数为Z和Z+1的正构烷烃加入到样品x中进行色谱分析，测得这三个物质的调整保留值分别为：tR（i)，tR（Z)和tR(z+1)，且待测物x的调整保留值需要介于两个烷烃之间。,保留指数仅与固定相的性质、柱温有关，与其它实验条件无关；其准确度和重现性都很好,只要柱温与固定相相同，就可应用文献值进行鉴定，而不必用纯物质相对照。,2利用化学反应定性：收集柱后组分，官能团反应定性鉴别（非在线）。3利用两谱联用定性：GC-MS，GC-IR。,二定量分析色谱定量的依据是当操作条件一致时，被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号成正比，即：i=fiAi式中i为被测组分i的质量；Ai为被测组分i的峰面积；fi为被测组分i的校正因子。进行色谱定量分析时需要：（1）准确测量检测器的响应信号峰面积或峰高；（2）准确求得比例常数校正因子；（3）正确选择合适的定量计算方法，将测得的峰面积或峰高换算为组分的百分含量。,（一）峰面积的测量,1对于对称峰:A=1.605hW1/22非正常峰（不对称峰）:A=1.605h(W0.15+W0.85)3自动求和（自动积分仪或色谱工作站）：直接给出A，h，W1/2,（二）定量校正因子,为了使峰面积能真实反映出物质的质量，就要对峰面积进行校正，即在定量计算中引入校正因子fi=mi/Ai式中fi值与组分i质量绝对值成正比，称为绝对校正因子。在定量分析时要精确求出fi值是比较困难的：一方面由于精确测量绝对进样量困难；另一方面峰面积与色谱条件有关，要保持测定fi值时的色谱条件相同，既不可能又不方便。,1相对校正因子相对校正因子fi为组分i与标准物质s的绝对校正因子之比fi=fi/fs=（mi/Ai）/（ms/As）=（mi/ms）（As/Ai）相对校正因子fi是当组分i的质量与标准物质s相等时，标准物质的峰面积是组分i峰面积的倍数。通过相对校正因子，可以把各个组分的峰面积分别换算成与其质量相等的标准物质的峰面积，于是比较标准就统一了，这就是归一化法求算各组分百分含量的基础,(2).相对校正因子的表示方法常用的标准物质，对于热导检测器（TCD）是苯，对氢焰检测器（FID）是正庚烷,相对质量校正因子,相对摩尔校正因子,相对体积校正因子,（三）定量方法,1归一化法2外标法3内标法,1归一化法,定义：所有出峰组分含量之和按100%计定量方法依据：组分含量与峰面积成正比.,特点：简便，准确，样品的所有组分必须全部流出，且出峰；某些不需要定量的组分也必须测出其峰面积及fi值