分子生物学-技术.ppt

分子生物学,阿周存,第三节：聚合酶链反应（PCR）,聚合酶链反应（polymerasechainreactionPCR）技术是KaryMullis发明的。它是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。在年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链锁反应，大家很快地纷纷采用这个方法在短短的几年内，迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的实际应用，被许多科学家视为近三十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。,PCR主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成，通过变性，待扩增的靶DNA双链成为两条单链DNA模板；退火时,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度下，以引物3端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板.经过2530个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106107倍。,一、PCR的原理,二、PCR反应系统的组成,引物酶dNTP模板Mg2+TaqDNA聚合酶Buffer(缓冲液),（一）模板,模板浓度过高会导致解链不完全，扩增效率下降，有时过高的浓度导致扩增不能启动；浓度过低，会影响产物的产率。,一般在25-50ul的反应体系，模板量100ng-200ng左右。,单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。,（二）四种脱氧三磷酸核苷酸（4dNTPs）,dNTP终浓度高于50mmol/L会抑制Taq酶的活性，高浓度dNTPs易产生错误掺入，导致产物中的某些碱基发生改变。而浓度太低，降低反应物的产量。一般浓度为200mol/L。,四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。,（三）引物（primer),引物在PCR反应中非常关键，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果（特异性和效率）。设计一对好的引物，PCR基本成功。,引物的量对反应也有较大的影响，浓度过高易形成引物二聚体且产生，非特异性产物出现，低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率，,常用量：25-50ul反应体系10-20pmol,如何引物设计。,三、TaqDNA聚合酶,最适延伸温度7075，在PCR反应混合液中，Taq酶在95的半寿期为40min，故在PCR循环中选用的变性温度，不宜高于95。,普通的Taq酶没有35外切酶活性，如果发生dNTP错误掺入，这种酶没有校正能力，因此运用Taq酶进行PCR，产物中可能出现点突变，对克隆不利。,Taq酶延伸片段长度为10kb以内。,现在利用高保真的VentTMDNA多聚酶可解决上述问题。该酶具有校正功能。在95的半寿期达23h。,Taq酶的活力受Mg2+离子的影响,Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低。,最佳浓度为1.5mmol/L,也可以根据具体情况调节。,五、PCR缓冲液,维持反应体系中PH值的稳定。,四Mg2+,三、PCR的特点,1、高度的灵敏性:极微量的模板DNA即可扩增大量产物，pg级扩增到紫外线可见的ug级（106)。,3、稳定可靠、重复性好，操作简便快速,2、高度的特异性:19个bp的引物随机出现的频率419=2.751010bp/次；其次，反应退火温度较高，引物非特异性结合很低.,2-3h可完成实验。,4.对标本的纯度要求低：DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。,四、PCR的基本过程,(一）引物的设计与合成,（二）构建反应体系（加样）,（三）循环反应,在循环反应开始前进行预变性：944-5min,1、变性：变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动,过高会影响酶活性。9430s（或951-2min),2、复性：复性温度过高会影响引物与模板的结合，降低扩增效率，太高则不能扩增，复性温度可通过下列公式估计。时间一般为30s。,Ta=Tm-5=4(G+C)+2(A+T)-5,3、延伸：72时酶催化核苷酸的标准速率可达35100个核苷酸/秒。延伸时间根据扩增片断的长度而定1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在17min。,4、循环次数：一般为2535个周期。,次数太少扩增效率低，次数太多则易出现错误和非特异性背景。,25个循环后一般可达到平台期（不再按指数增加）。,94,55,72,五、PCR中应注意的事项,PCR反应中可能出现的问题：假阴性（不出现扩增条带）、假阳性、出现非特异扩增带,（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板,注意的事项：,六、PCR相关技术,1、巢式PCR（nestPCR）：用两对引物分两步扩增目的片断，第一对在第二对引物的外则，先用第一对引物扩增，然后以第一次扩增的产物作模板进行第二次扩增，以增强目的片断的扩增效率和特异性。,2、多重PCR（mutiplexPCR：在同一PCR体系中加入数对不重叠区域的引物，同时扩增多个DNA片段。,各对引物的退火温度相近。,多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失、多个基因的缺失，或在检测缺失设置内对照。,3、反向PCR（InversePCR或ReversePCR）,是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。,可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列。,4、LP-PCR（Labelledprimers)（标记PCR，彩色PCR）,荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。,特别适合大量临床标本的基因诊断，可同时检测多种基因成分,5、不对称PCR扩增产生特异长度的单链DNA的。方法：采用两种不同浓度的引物。其比例一般是150。,用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针,6、逆转录PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR),RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR的扩增技术。,使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ngug水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。,用于构建cDNA文库,7、定点突变技术,（1）寡核苷酸介导的定点突变技术,Smith70年代创立，1993年获诺贝尔奖。,有目的使基因在特定的位置发生突变，从而研究基因的功能，以及氨基酸对结构和功能的影响。,(2)重叠延伸介导的定点突变技术,利用PCR技术进行基因的定点突变，操作简便。,1遗传病的遗传病的诊断和产前诊断2致病病原体的检测3癌基因的检测和诊断4个体识别、亲子关系鉴别及法医物证5动、植物检疫6高科技生物医学领域中的应用基因克隆、分子杂交、测序、转基因动植物等,七、PCR应用领域,第四节DNA测序,DNA碱基序列测定即DNA一级结构的测定，经典方法为Maxam-Gilbert（1977）建立的化学裂解法和Sanger（1977）建立的双脱氧末端终止法。,随着PCR技术的发展，在双脱氧末端终止法的基础结合PCR技术，建立了循环测序法（目前最常用的）。,一、双脱氧末端终止法,双脱氧核苷酸（ddNTP)具有阻断DNA复制的作用，若以待测得DNA片断为模板，在DNA聚合和引物、四种dNTP（四个反应管中又各含一种ddDNAP)存在的情况下进行复制，则在每个反应管中会得到具有相同末端而长度不同的片断。如在含有ddATP的反应管中，DNA链终止于A的位置，从而得到一系列A为末端的不同长度的片，其它三个反应管分别得到T、G、C为末端的片断。反应终止后，四个反应管的产物同时在一块聚丙烯酰胺凝胶上电泳，即可读出DNA的碱基顺序。,二、循环测序法,在体外反应体系中，加入待测的DNA模板、测序引物、TagDNA聚合酶、四种dNTP、四种分别用不用颜色荧光标记的ddNTP，然后进行循环反应，形成长短不一的末端不同的(荧光颜色不同的DNA片断，然后在DNA自动测序仪上电泳，同时检测荧光信号，并通过电脑分析，读出待测DNA的序列。,引物设计的原则:,1、引物长度一般不低于18bp,最佳为20-24bp,位于目的片断的两侧。,5aatgtaacctattgatggacattttggttgttttctgtttggggaagtgccatttttcacagttaagaaaaagtcagaaatttatcctaaaaattctgcagaatcaaaaaccacaatgaccctcggggtttccacttggaaaattattacaaactgtatttttgcttatgagctttatattgcactgccctga正向引物5ttgcatctgaaggagtgc3actgtgacctgttggagttgtttgcatctgaaggagtgcttaaaacccttttctccccagTTCCCAGAGGCACCGACATCACTAAACAGATTATAATTGGCACTCCTGGGACTGTCCTAGATTGGTGTTTTAAACTAAAATTGATTGATTTGACTAAGATTCGTGTGTTTGTCCTGGATGAAGCAGATGTGATGATTGACACTCAAGGATTCTCAGATCATAGTATTCGTATTCAAAGgtaatcttcagagtcttcctctcttcctcagccttctgtccagatggggaatttcatttgtttactcctccacatt3gtcggaagacaggtctac5反向引物atctttattgcttaactcctcaccaccttcacctctaaaataaatttgagtttttacattattttcaccagttcaagggtccctcagactgct3,有时引物不起作用，理由不明，可移动位置来解决。,2引物的（G+C）%含量组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似，在已知扩增片段（G+C）%含量时宜接近于待扩增片段；一般以40%60%为佳。两条引物的Tm值的差异最好不要超过2。,3引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpinstructures）。,4引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，即使无法避免，其3端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”。（Primerdimer）,所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。,5、DNA聚合酶是在引物3端添加单核苷酸，所以，引物3端56个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格。5端无严格限制。,3,5,5,限制性内切酶的识别序列,3,5,在扩增目的片断的同时，引入限制性内切酶切点,5,6、引物设计后以后，还需通过internet与人类基因组数据库比对，了解其特异性。,5gaaaaagtcagaaatttatcctaaaaattctgcagaatcaaaaaccacaatgaccctcggggtttccacttggaaaattattacaaactgtatttttgcttatgagctttatattgcactgccctgaactgtgacctgttggagttgtttgcatctgaaggagtgcttaaaacccttttctccccagTTCCCAGAGGCACCGACATCACTAAACAGATTATAATTGGCTGATTTGACTAAGATTCGTGTGTTTGTCCTGGATGAAGCAGATGTGATGATTGACACTCAAGGATTCTCAGATCATAGTATTCGTATTCAAAGgtaatcttcagagtcttcctctcttcctcagccttctgtccagatggggaatttcatttgtttactcctccacattatctttattgcttaactcctcaccaccttcacctctaaaataaatttgagtttttacattattttcaccagttcaagggtccctcagactgct3,5ctgtatttttgcttatgagctttatattgcactgccctgaactgtgacctgttggagttgtttgcatctgaaggagtgcttaaaacccttttctccccAgTTCCCAGAGGCACCGACATCACTAAACAGATTATAATTGGCTGATTTGACTAAGATTCGTGTGTTTGTCCTGGATGAAGCAGATGTGATGATTGACACTCAAGGATTCTCAGATCATAGTATTCGTATTCAAAGgtaatcttcagagtcttcctctcttcctcagccttctgtccagatggggaatttcatttgtttactcctccacattatctttattgcttaactcctcaccaccttcacc3,5aaacccttttctccccagTTCCCAGAGGCACCGACATCACTAAACAGATTATAATTGGCTGATTTGACTAAGATTCGTGTGTTTGTCCTGGATGAAGCAGATGTGATGATTGACACTCAAGGATTCTCAGATCATAGTATTCGTATTCAAAGgtaatcttcagagtcttc3,(第一对引物扩增）,(第二对引物扩增）,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,内对照,1,2,3,AZF区的缺失检测,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,病毒1病毒2病毒3病毒4,不同病毒的引物用不同颜色的荧光标记,标记引物,观察,PCR产物,高浓度引物,低浓度引物,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA模板,杂化双链,PCR扩增,cDNA文库的构建,1、制备mRNA,从总RNA中分离mRNA。