RT-PCR和real-time-PCR-原理及步骤PPT课件

.1、逆转录-聚合酶链反应和实时荧光聚合酶链反应的原理和程序，2、聚合酶链反应的定义，简称聚合酶链反应，是一种在短时间内大量扩增特定DNA片段的分子生物学技术。TaqDNA聚合酶经过反复循环后仍具有活性，因此反应系统自动重复进行所需DNA片段的酶促合成，使反应产物呈指数增长，故称之为聚合酶链式反应。3、聚合酶链反应原理，10种扩增缓冲液，4种脱氧核糖核酸混合引物模板脱氧核糖核酸聚合酶Mg2加双或三倍蒸馏水，4、4、和，逆转录酶，脱氧核糖核酸聚合酶，核糖核酸，cDNA，杂交双链，聚合酶链反应扩增，逆转录聚合酶链反应原理，5、1。总核糖核酸的提取。(试剂盒说明)，逆转录-聚合酶链反应的基本步骤，缓冲液混合引物总核糖核酸逆转录酶DEPC水(试剂盒说明)，2。逆转录合成cDNA。3.聚合酶链反应和凝胶去除。ddh2o 10 mdntp 10 pcrbbuffermgcl 2上游引物下游引物模板cDNATaq Taqenzyme，6、实时荧光原理，通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对聚合酶链反应产物进行标记和跟踪，实时在线监测反应过程，结合相应的软件对结果进行分析，计算出待测样品的初始模板量。内部掺杂的染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqMan分子信标双探针(FRET)引物特异性探针扩增荧光(Intergen)。7、8、9，10、荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的值，可以在荧光信号指数扩增阶段的任何位置设定，一般荧光域值的设定是基线(背景)荧光信号标准偏差的10倍。当每个反应管中的荧光信号达到设定的阈值时，所经历的循环次数称为CT值。11，定量聚合酶链反应的数学原理，12，12，13，斜率和扩增效率，14，14，15，标准物质，16，标准物质梯度稀释法，17，1，SYBRGreen法，18，SYBRGreen熔解曲线分析，19，SYBR Green法的优缺点，优点：对DNA模板没有选择性，并且适用于任何DNA。它使用方便，不需要设计复杂的探头。它非常敏感而且便宜。20的优势。Taqman对靶序列具有高特异性，尤其适用于单核苷酸多态性检测。与分子探针相比，TaqMan设计相对简单，价格高，仅适用于特定目标，不能进行熔解曲线分析。分子信标的优点是对靶序列具有高特异性。对单核苷酸多态性检测最敏感的试剂之一是荧光背景。低分子信标的缺点很难设计。没有端点分析功能只能用于特定的高价目标。其他荧光标记方法。21，绝对量化和相对量化的定义。22，绝对定量，AQ)病原体检测转基因食品检测基因表达研究相对定量(RQ)基因表达差异在不同组织中的耐药性评估研究，23，绝对定量标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，稀释系列。标准样品的类型：含有与待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有cDNAPCR产物。24个与待测样品相同的扩增片段。相对定量由内标确定。内标(internal standard)通常是细胞中看家基因如-肌动蛋白和GAPDH基因的表达量，或者基因组中的拷贝数是恒定的。受环境因素影响的小的内标定量结果代表样品中包含的细胞或基因组的数量。25和相对定量分析方法1-Ct，条件是目标序列和内部参考序列的扩增效率接近100%且偏差在5%以内。1、内部参考基因的CT值用于归一化目标基因的CT值：CT(测试)=CT(目标，测试)-CT(参考，测试)CT(校准品)=CT(目标，校准品)-CT(参考，校准品)2，用校准样品的CT值归一化测试样品的CT值：CT=