DNA重组技术的基本工具zb.ppt

,专题一基因工程,基因工程的概念：,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。,基因工程的概念,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,优点与杂交育种相比：克服远缘杂交不亲和障碍。与诱变育种相比：定向改造生物性状。,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),重组DNA,导入,形成,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,形成重组DNA,关键步骤三：,重组DNA导入受体(棉花)细胞,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,关键步骤一的工具：,关键步骤二的工具：,关键步骤三的工具：,基因的剪刀限制性核酸内切酶,基因的针线DNA连接酶,基因的运输工具运载体,第一节DNA重组技术的基本工具,作用实质：作用结果：特点：,断裂磷酸二酯键,产生黏性末端或平末端,专一性（特异性）,可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。,来源：主要是微生物,一、“分子手术刀”限制性核酸内切酶,脱氧核苷酸的结构,G,A,3,5-磷酸二酯键,3端,5端,3端,5端,磷酸二酯键,仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？,限制酶的识别序列,限制酶所识别的序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列,中轴线,在G与A之间切割,EcoRI限制酶的作用,大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶EcoR能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,黏性末端,黏性末端,EcoRI限制酶的切割,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,中轴线,SmaI限制酶的作用,在G与C之间切割,平末端平末端,SmaI限制酶的切割,什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,寻根问底,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,提醒切割的化学键为磷酸二酯键。在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶,目的是产生相同的黏性末端。将一个基因从DNA分子上切割下来,需要2个限制酶,同时产生4个黏性末端。不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同,同一个DNA分子用不同的限制酶产生的黏性末端不相同。,一、“分子手术刀”限制性核酸内切酶,2、“分子缝合针”DNA连接酶,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,磷酸二酯键,作用实质：,形成磷酸二酯键,限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接时，所用DNA连接酶是否一样呢？,DNA连接酶的种类：,两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来,DNA连接酶的缝合作用,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？,T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,DNA连接酶的缝合作用,寻根问底：,限制性内切酶的识别序列和切点是GGATCC，限制性内切酶的识别序列和切点是GATC。在质粒上有酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的切点。（1）请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性末端。（3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？,可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）,小试身手,例2、图6-2-1为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是A.B.C.D.,c,3、“分子运输车”运载体,种类：质粒、噬菌体和动植物病毒,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，还得将这个基因送到乙生物的细胞内去！能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。,作用：将重组基因导入受体细胞,作为运载体的必要条件,1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2.具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3.具有某些标记基因，便于进行筛选。如：抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。4.对受体细胞无害。,质粒：,质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的DNA分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的DNA分子。质粒是基因工程最常用的运载体。绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。,质粒的特点,1、细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状DNA分子；2、质粒的存在对宿主细胞无影响；3、质粒的复制只能在宿主细胞内完成。,大肠杆菌的质粒：,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。,随堂练习：,1、关于限制酶的说法中，正确的是（）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中,答案：C,2、下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是ABCD,答案：D,对位训练3.下列关