7重组子的筛选与鉴定.ppt

基因工程,第七节重组子的筛选与鉴定,一、重组子的筛选,转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的细胞称为转化子。重组子：含有DNA分子的转化子成为重组子。,1.根据载体选择标记基因初步筛选转化子,一般的做法是将转化处理后的受体细胞接种在合适的选择药物的培养基上在最适生长温度条件下培养一定时间，根据菌落生长的状况即可挑选出转化子。,(插入失活法)抗药性标记选择,1.根据载体选择标记基因初步筛选转化子,选择培养基：是根据需要检测细胞的类型配制的培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB培养基上加入适量的某种选择药物即为选择培养基。选择药物：由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定，多与标记基因的遗传表型相对应，主要有抗菌素和显色剂等。,（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子,利用载体DNA分子上的抗药性选择标记基因进行的筛选方法，多用于大肠杆菌转化子的筛选。氨苄青霉素：Ap或Amp，含bla基因的菌体能转译-丙酰氨酶，可降解Ap，抗Ap菌落的选择剂为终浓度3050ng/ml，贮存液为25mg/ml水溶液。,（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子,氯霉素：Cm，Cmp，含Cat基因的菌体能转译氯霉素乙酰转酰基酶，使Cm乙酰化而失效。抗Cm菌落的终浓度为30g/ml，贮存液为34mg/ml乙醇溶液。卡那霉素：Km，kan，含kan抗性基因的菌体转译能修饰km的酶，阻碍Km对核糖体的干扰，抗Km菌落的终浓度为5g/ml，贮存液为25mg/ml水溶液。,（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子,链霉素：Sm，Str，含Str抗性基因的菌体转译一种能修饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体的结合，抗Sm菌落的终浓度为25g/ml，贮存液为20mg/ml水溶液。四环素：Tc，Tet，含Tc抗性基因的菌体转译能改变细胞膜的蛋白，防止Tc进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成，抗Tc菌落的终浓度为12.515.0g/ml，含Tc培养基中不可加Mg盐，因Mg盐拮抗Tc，贮存液为12.5mg/ml乙醇-水溶液，含Tc溶液与培养液均应在暗处存放。,（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子,挑选转化子菌落时，必须根据转化处理时对照处理组菌落生长情况来定。一般DNA对照组和感受态细胞对照组不应生长菌落，而感受态细胞有效性对照组应长菌落，如其中一项不符，就有出现假转化子菌落的可能，这样的菌落不宜作为转化子，而用于进一步实验材料。如用Tc，Cm，Ap等选择药物，观察和确定转化子时间不宜过长1316h为宜，否则会现假转化菌落。药物的自然降解也出现假菌落。,（2）插入失活筛选法利用质粒载体的双抗药性继续筛选,用（1）的筛选获得的大量转化子中同时包括需要的重组子，也含有非必需的非重组子方法：将Apr的转化子影印至含抗生素Tc的平板上。由于外源DNA片段插入载体DNA的BamHI位点导致载体Tcr基因失活，因此带选择的重组子含有AprTcs的遗传表型，而非重组子则为AprTcr。即重组子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成菌落，而非重组子在这两种平板上都能形成菌落，比较两种平板上对应的转化子的生长状况，即可Ap板上挑出重组子。,（3）插入表达筛选法利用目的基因插入载体后能激活标记基因而筛选,与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的筛选标记基因才能表达。,（4）显色筛选法,常用的显色剂是x-gal(5-溴4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)。具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译-半乳糖苷酶、透过酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙基-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段lacZ，则重组DNA分子转化lacZ互补型菌株，则在含有x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而lacZ得到的转化子是白色菌落。,蓝白筛选示意图,蓝-白筛选利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。,载体：编码-半乳糖宿主：编码-半乳糖苷酶N端序列苷酶C端序列,-互补,细菌表达：-半乳糖苷酶活性,5-溴-4-氯-3-吲哚（X-gal）形成蓝色菌落,当在质粒中插入外源DNA-半乳糖苷酶的N端基因失活不能与宿主-半乳糖苷酶的C端进行-互补产生白色菌落。,（IPTG存在下）,（5）利用报告基因筛选植物转化细胞,报告基因：在植物转基因中，载体携带的选择标记基因经常称为报告基因。在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达而筛选转化细胞；同时，报告基因可以和某些目的基因构成嵌合基因，通过报告基因的表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列，常用的报告基因有抗生素抗性基因及编码某些酶类或其它特殊产物的基因等。,-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因,Gus基因最早是从E.coli12中克隆出来的，能编码稳定的Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选择标记。作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细胞所产生的-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而区分是否是转化子。,-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因,例如，Gus能够催化裂解人工合成的底物4-甲基伞形花酮-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形花酮，通过荧光光度计进行定量测定。Gus基因被广泛用于植物转化子筛选，尤其是在进行外源基因瞬间表达系统中。,转基因番茄叶片阴性对照,-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因,gus基因的3端与其他结构基因连接产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有Gus活性，利用组织化学分析等可以定位外源基因在不同的细胞、组织和器官类型以及发育时期的表到情况，这是其它报告基因所不及的。,新霉素磷酸转移酶（NPT）基因,新霉素与卡那霉素庆大霉素均属于氨基环醇类抗生素，结构相似，能抑制原核细胞核糖体70s起始复合物的形成，从而阻碍蛋白质的合成，抑制细胞生长。Npt基因编码序列来自大肠杆菌易位子Tn5，可催化ATP上-磷酸基因转移到抗生素分子的某些基因上，从而阻碍抗生素分子与靶位点的结合，并使抗生素失活。,新霉素磷酸转移酶（NPT）基因,故在含有抗生素的培养基上培养植物转化材料，仅有携带NPT基因的转化植物细胞才能活下来，由此区分转化子与非转化子。NPT基因在多数转基因植物上应用广泛。缺点：受体细胞通常具有较高的非特异性磷酸转移酶底物，筛选时假阳性序列较多，NPT酶活一般是通过卡那霉素与-32pATP的原位磷酸化来检测。,荧光素酶（LUC）基因,Luc是一种源于萤火虫的动物蛋白基因产物，能够催化生物发生荧光反应。Luc在Mg2+的作用下，可与荧光素和ATP底物反应，使荧光素转变为处于激活状态的氧化荧光素，同时发射光子，利用荧光测定仪可快速检测，故可作为报告基因。Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用于调控序列和基因的组织特异性表达。,荧光素酶（LUC）基因,特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。,叩头虫和不同克隆的LUS表达的不同颜色荧光。,插入了萤火虫荧光素酶基因的烟草,抗除草剂bar基因,Bar基因编码PPT-乙酰转移酶（PAT），能解除非选择性除草剂的毒性，从而使转基因植物细胞产生对除草剂的抗性，故可作为报告基因进行正向选择。用于植物转基因研究工作。,绿色荧光蛋白基因Gfp,绿色荧光蛋白在395nm波长下被激发产生绿色荧光，故可作为报告基因。其中水母gfp被广泛用于筛选动植转化子。,冠瘿碱（opine）合成酶基因,主要包括胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成酶基因。在植物细胞中的表达产物可催化一些特殊反应，通过电泳分离及菲醌荧光染料染色后，即可观察到产物的生成。用于转植物基因细胞的筛选。,氯霉素乙酰转移酶（Cat）基因,氯霉素可选择性的与原核生物细胞50s亚基结合，抑制肽酰基转移酶活性，最终抑制细胞生长。Cat基因可以催化乙酰辅酶A转乙酰基，使氯霉素失活，故外源DNA与供转化的Cat基因能使转基因植物具有抗氯霉素的能力。,潮霉素磷酸转移酶（HPT）基因,潮霉素原是一种链霉素的产物，能与70s和50s核糖体的结合来抑制多种原核、真核生物的生长。HPT酶能催化ATP上的磷酸集团转移至潮霉素分子上，而使之失活，所以使用潮霉素基因作为报告基因，可赋予转化植物细胞抗潮霉素的能力。但潮霉素能够致瘤，因而操作时应慎重。,（6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞,即核苷酸合成代谢酶基因缺失互补。前已述及的植物转化子筛选的氯霉素乙酰转移酶基因和新霉素磷酸转移酶基因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。此外还有以下方法：,胸腺激酶（TK）基因,胸腺激酶能把胸苷转化为胸苷磷酸，以保证核苷酸的顺利合成，其编码基因（tk）几乎在所有的真核细胞中都能有效表达，故tk可作为遗传选择记号，来确定哺乳动物的基因转移，相应的受体细胞为遗传表型的缺陷型。据转化的方法不同，转基因动物细胞的筛选方式分为HAT选择法和共转化选择法两种。,胸腺激酶（TK）基因,HAT选择法的原理：利用培养基中的叶酸类似物氨基喋呤（APT）阻断细胞核苷酸的合成途径，启动以次黄嘌呤为底物的补救合成途径。该途径不受APT的抑制，能继续合成出所需核苷酸。由于在HAT培养基中不加外源胸苷，通过TK酶的作用，tk+细胞能以其为底物合成出TTP，故tk+细胞可以存活，而tk-细胞不能合成而死亡。,二氢叶酸还原酶(DHFR)基因,DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，故不能在常规培养基上生长。但在常规培养基中加入次黄嘌呤和胸苷，则突变体细胞可借助核苷酸的补救合成途径维持生长。,黄嘌吟-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)基因,XGPRT是由大肠杆菌某些基因编码的一种核苷酸代谢酶，哺乳动物缺失此酶，但却存在次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）。XGPRT能有效地把黄嘌呤转化为黄苷-磷酸，并最终形成鸟苷磷酸，而HGPRT只能利用次黄嘌呤和鸟嘌呤，并最终形成黄苷-磷酸（IMP），据此特性，可作为筛选哺乳动物基因转移的一种显性选择记号。,2.营养缺陷型检测法,根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛选含目的基因的克隆子。如果目的基因产物能够降解某些药物使菌株呈现出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是显色反应，则可根据抗性或颜色变化直接筛选含目的基因的克隆子。,3.形成噬菌斑筛选法,对于DNA载体系统而言，外源DNA插入噬菌体载体后，重组DNA分子大小必须在野生型DNA长度的75105范围内，才可以在体外包装成具有感染活性的噬菌体颗粒，转导受体菌，在培养基上形成噬菌斑，未转导的受体菌继续正常生长，而区分开来。,3.形成噬菌斑筛选法,如果在重组过程中使用的是取代型-载体，则噬菌斑中的-噬菌体即为重组子。因而空载的-DNA分子不能被包装，难以进入受体细胞产生噬菌斑。如果使用插入型-载体，由于空载的-DNA大于包装下限，所以也能被包装成噬菌体颗粒并产生噬菌斑，此时筛选重组子可以利用-载体上的选择标记基因（如lacZ等），当外源DNA片段插入lacZ基因内时，重组噬菌斑无色透明，而非重组的噬菌斑则为蓝色。,基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。克隆基因表达有三个条件基因的编码区不能被插入序列中断;基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主细胞的RNA聚合酶有效地识别;mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。,二、重组子的鉴定,1.根据DNA分子的结构特征鉴定重组子（1）根据重组DNA分子大小鉴定重组子（2）限制酶酶切重组DNA分子鉴定重组子（3）利用PCR扩增筛选确定重组子2.核酸分子杂交检测法3.根据DNA核苷酸序列鉴定重组子4.免疫化学检测法5.其他方法,（1）根据重组DNA分子大小鉴定重组子,这是在转化子初步筛选的基础上进一步对重组子进行筛选和鉴定的一种方法，主要是根据有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体DNA之间的大小差异来鉴定重组子。由于重组DNA是载体DNA中插入了外源DNA片段，其分子量大于载体DNA分子，在琼脂糖凝胶板上出现的DNA带中，落后的带是重组DNA的带。此方法只用于重组子的初步鉴定。,（1）根据重组DNA分子大小鉴定重组子,此法直观快捷，只需获得质粒DNA分子的粗制裂解液即可进行琼脂糖凝胶电泳，尤其适用于插入片段较大的重组子的筛选与初步鉴定。,酶切分析法长度鉴定,（2）限制酶酶切重组DNA分子鉴定重组子,通过（1）法虽然可以初步筛选到重组子菌落，但却难以将其中的期望重组子与非期望重组子区分。因为重组质粒DNA分子中，质粒载体可能会与一个以上的外源DNA片段连接重组，而通过酶切法不仅可以进一步筛选鉴定重组子，而且能够判别外源DNA片段的插入方向及分子质量的大小。,基本做法,从转化菌落中随机挑选出少数菌落，快速提取质粒DNA，用限制酶酶解，并通过凝胶电泳分析来确定是否有外源基因插入及插入方向等。,酶解方式主要有两种,全酶解法：用一种或两种能够将外源DNA片段从重组质粒上切割下来的限制酶酶解质粒DNA，凝胶电泳后重组质粒分子较单一载体质粒多出一条泳带。据此将重组子与非重组子区分开来。如果插入片段与质粒大小相近，则最好用合适的酶使之线性化，通过比较大小确定是否为重组子。进一步利用在外源DNA片段上具有识别位点的一种或几种限制酶酶解重组质粒分子，根据酶切图谱分析即可判别插入片段的方向。,酶解方式主要有两种,部分酶解法：是用一种或数种限制酶对重组质粒DNA分子进行部分酶解分析，据产生的限制性片段大小，来确定限制酶识别位点的准确位置及各片段的正确排列方式而进行筛选鉴定。部分酶解法较全酶解法易行，两者通常用于当载体和外源DNA片段连接后产生的转化菌落比任何一组对照连接反应（如只有酶切后的载体或只有外源DNA片段）都明显多时的重组筛选。,（3）利用PCR扩增筛选确定重组子,在载体DNA分子中，外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的。通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，已从初选出来的阳性克隆中提取的少数质粒DNA为模板进行PCR反应，反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，如出现特异性扩增DNA带，并且其分子量同预期的一致，则可确定此重组DNA分子的重组子即为期待的重组子。PCR法不但可迅速扩增插入片段，而且可直接用于DNA序列测定。,2.核酸分子杂交检测法,（1）基本原理具有一定同源性的两条核酸(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度持异地复性形成双链。该技术也可用于重组子的筛选鉴定，杂交的双方是待测的核酸序列和用于检测的已知核酸片段(称为探针)。这也是目前应用最为广泛的一种重组子的筛选方法，只要有现成的DNA或RNA探针，就可以检测克隆子中是否含有目的基因。,2.核酸分子杂交检测法,（2）基本做法将待测核酸变性后，用一定的方法将其固定在硝酸纤维素膜(或尼龙膜)上，这个过程也称为核酸印迹转移，然后用经标记示踪的特异核酸探针与之杂交结合，洗去其他的非特异结合核酸分子后，示踪标记将指示待测核酸中能与探针互补的特异DNA片段所在的位置。,2.核酸分子杂交检测法,（3）分类核酸分子杂交检测法实际上是一种依赖于重组子结构特征进行的重组子筛选方法。根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法不同，核酸分子杂交检测法可分为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、Southern印迹杂文和Northern印迹杂交四类。,2.核酸分子杂交检测法,（4）核酸杂交的探针DNA杂交探针：是指具有一定序列的核苷酸片段，它能与互补的核酸序列复性杂交，并且通过适当标记进行检测。核酸杂交探针的种类A.同源或部分同源探针：是指与目的基因的部分序列完全互补的核酸探针，长度约为19-24个核苷酸。,B.总cDNA探针：是利用逆转录酶的作用，对生物细胞总的或经分离的poly(A)mRNA进行示踪标记制备的，用于对高丰度的mRNA的cDNA克隆的筛选。C.特异性cDNA探针：利用某种方法从目的细胞中筛选获得某些特异性的cDNA片段，一般用于筛选cDNA文库中那些对应于低丰度的mRNA的目的克隆。D.人工合成的寡核苷酸探针：其序列是根据目的蛋白的一小段已知氨基酸序列推导合成出来的，用于基因组DNA文库或cDNA文库的筛选。,2.核酸分子杂交检测法,（5）探针标记法32P、3H、35S等放射性标记物。生物素、地高辛、荧光素、汞离子、金颗粒、银颗粒等非放射性标记物。,多功能数字核辐射仪,辐射检测仪,3.根据DNA核苷酸序列鉴定重组子,通过以上方法确定重组子的重组DNA分子中含有外源DNA片段后，为了进一步肯定此外源DNA片段是(或者含有)预期的DNA片段(目的基因)，可以对外源DNA片段进行核苷酸序列的测定。DNA序列测定，即核酸一级结构的测定，简称DNA测序。对克隆DNA片段进行序列测定及分析，不仅可以直观地鉴定出重组DNA分子中是否含有目的基因，也可以获得目的基因的编码序列和基因调控序列。,（1）发展史,1963年，Sanger等首次完成胰岛素51个氨基酸序列测定；1965年，Hlley等成功测定了酵母tRNAAla的75个核苷酸顺序，同年Sanger提出了指纹图谱法测定小RNA序列；1975年，Sanger首次设汁了利用DNA聚合酶进行聚合反应的所谓加减法DNA测序程序，这种方法的测定误差率较高，但却开辟了DNA测序的新思路；1977年，Maxam等建立了一种用化学降解法分析DNA序列的程序，即化学直读法，快速可靠，试剂简单，测定了pBR322全部4363bp的DNA序列；1977年，Sanger提出了双脱氧链终止法DNA测序技术，是目前最为常用的DNA测序方法。,（2）DNA测序方法,DNA化学降解测序法，亦称Maxam-Gilbert测序法；双脱氧链终止法，亦称Sanger测序法；大片段DNA的测序。,（3）DNA测序技术的发展,非放射性标记检测物的使用DNA测序自动化计算机在测序中的应用现有技术的改进：,（3）DNA测序技术的发展,现有技术的改进：以凝胶电泳为基础的测序方法：DNA全自动序列分析系统包括单色荧光标记四泳道法和四色荧光标记单泳道法；超薄层板凝胶电泳激光荧光法；PCR测序技术；毛细管及列阵毛细管电泳激光荧光法（高效、快捷、加样量少、灵敏度高、在线自动化检测）非电泳分离的测序方法：杂交法、原子探针显微镜法、流动式单分子荧光检测法。,（1）酶联免疫吸附法,机理：酶免疫法和其他免疫方法一样，都是以抗体和抗原的特异性结合为基础，其差别在于该法以酶或辅酶作为标记物，标记抗原或抗体，利用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应。其特点是利用聚苯乙烯微量反应板（或球）吸附抗原或者抗体，使之固定化，在其中进行免疫反应和酶促反应。,（1）酶联免疫吸附法,分类：测定抗体的间接法测定抗原的双抗体夹心法测定抗原的竞争法捕获法测定IgM抗体ABS-ELISA法PCR-ELISA法斑点免疫酶结合试验,（1）酶联免疫吸附法,实验过程：包被：将已知抗原或抗体物理吸附到固相载体表面，使之固定化；抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，通过免疫反应而被结合固定；酶促反应：在反应体系中加入酶、作用底物，使之发生酶促反应而显色。,（2）Western印迹法,亦称免疫印迹法，是在凝胶电泳技术和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫检测技术，结合了电泳分辨率高及免疫反应特异性强的双重优点，是目前蛋白质研究中的重要手段之一。该法原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针来检测转移到固相支持物上的蛋白质分子，结果为阳性的即为重组子。,（2）Western印迹法,程序过程：蛋白质样品制备SDS-PAGE分离蛋白质转膜标记抗体与膜上蛋白质抗原杂交检测并分析标记物信号,蛋白质筛选法用来检测同DNA特异性结合的蛋白质因子的一种方法。操作程序：1.用硝酸纤维素滤膜进行“噬菌斑转移”，使其中的蛋白质吸附在滤膜上；2.将滤膜同放射性标记的含有DNA结合蛋白质编码序列的双链DNA寡核苷酸探针杂交；3.根据放射自显影结果筛选出阳性反应克隆。,（3）免疫沉淀测定法,该法是将抗体分子预先结合到磁珠等固相载体上，然后与含有目的蛋白的细胞裂解液进行液相杂交反应，利用磁场或离心等技术将结合在抗体上的蛋白质收集起来，电泳分离，来鉴定重组子。例如在长有转化子菌落的培养基中，加入目的基因产物相对应的标记抗体，如菌落产生与抗体相对应的抗原蛋白，则周围就会出现抗原-抗体沉淀物，形成有色圆环。该法操作简便，但灵敏度不高，实用性较差。,（4）免疫荧光法（IF）,用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检样本中抗原反应，在荧光显微镜下观察，若出现复合物发光现象既可判定。直接法：用荧光标记抗体/原检测未知的抗原/体；间接法：用已知荧光标记的抗体检测未知抗原。,（5）固相放射性免疫测定法（RIA）,该法是应用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测转化子，兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体的高特异性，可检测灵敏度pg水平。常用标记的放射性核素为125I和131I，可分为固相和液相两种方法。该法多用于测定微量物质如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、地高辛、IgE等。,（5）固相放射性免疫测定法（RIA）,例如含有重组质粒DNA的菌落，可以产生蛋白质A和蛋白质B融合形成的杂种多肽A-B，如何从转化子菌群中检测出含A-B的克隆？可以把抗（A-B）杂种多肽中A部分固定在支持物上，再把抗B的抗体在体外用125I标记上，作为检测抗体使用，因第一种抗体只同A部分的蛋白结合，标记的第二种抗体只同B部分的蛋白结合，所以只有含A-B的克隆才能呈现阳性反应，从而检测出重组DNA分子。,4.免疫化学检测法,在某些情况下，如待测的重组克隆子既无任何可供选择的基因表型特征，又无理想的核酸杂交探针时，可以考虑采用免疫学方法筛选重组子。该法的基本过程与前述菌落杂交法相似，不同的是该法使用抗体探针，而非DNA探针来鉴定目的基因表达产物。免疫学检测法具有专一性强、灵敏度高的特点，只要有一个拷贝的目的基因在克隆子细胞内表达合成蛋白质就可以检测出来。,5.其他方法简介,（1）转译筛选法（2）亚克隆法（3）电镜作图检测法（4）质谱分析法,（1）转译筛选法,突出优点在于将克隆的DNA同所编码的蛋白质产物之间的关系对应起来。该法不作为筛选重组克隆子的常规手段。繁杂杂交抑制转译检测法：所依据的原理是，在体外无细胞的转译体系中，目的基因的转录产物mRNA一旦同DNA分子杂交，就不能指导蛋白质多肽的合成。用于目的基因编码丰富的mRNA。,（1）转译筛选法,杂交选择转译检测法：有时也称杂交释放转译法，比杂交抑制转译法灵敏度更高的阳性重组子筛选方法，可适用于低丰度mRNA(只占总mRNA的0.1%左右)产物的cDNA重组分子的检测。通过杂交手段选择目的mRNA进行体外转译，而不是抑制目的mRNA的转译。,转译筛选法1.杂交抑制的转译该方法用于cDNA文库中目的基因的筛选。其原理是在体外无细胞的转译中利用cDNA与mRNA杂交后导致mRNA的不能翻译，从而筛选阳性克隆子。分离的基因编码着丰富的mRNA。优点：不需要克隆基因的表达，不需要探针或抗体。缺点：较烦琐。,步骤：1.将从大肠杆菌菌落或噬菌体群体中制备的带有目的基因的重组质粒DNA变性后，与总mRNA杂交；2.转入无细胞转译体系（麦胚提取物或兔网织红细胞提取物）,由于加有35S标记的蛋氨酸，转译的多肽蛋白质可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行分析；3.结果同未杂交的mRNA转译产物作比较，从中找出其转译合成被抑制的mRNA，即同目的基因变性DNA互补彼此杂交的mRNA。,2.杂交选择的转译是一种直接的选择法，比杂交抑制的转译要敏感得多，而且还可适用于低峰度的mRNA之cDNA重组分子的检测。,（2）亚克隆法,阳性重组子经筛选并鉴定出来后，还需作进一步定位工作。因为克隆片段与整个目的基因很难完全吻合，一般较小的目的基因或cDNA基因可以完整地包含在克隆片段内，而较大的目的基因可能会分散在不同的克隆片段中，亚克隆法是一种精确、极有价值的分析方法。,（2）亚克隆法,所谓亚克隆法，亦称次级克隆(subcloning)是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆。一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后，将所得各片段分别重组到载体上，再转化宿主细胞，通过对转化细胞的表型鉴定或其他方法来确定基因所在的位置。,（3）电镜作图检测法,用于克隆基因的定位研究。基本原理：在一定条件下，DNA分子中某些特殊的区段，如AT丰富区段、不同DNA分子的同源区段及与RNA分子同源的DNA区段等，能呈现出特殊的结构，利用电子显微镜进行观察作图，可以鉴定这些结构。,R-环检测法：鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源区域在临近双链DNA变性温度下和高浓度的甲酰胺溶液中（70%），双链的DNA-RNA分子比双链的DNA-DNA分子更加稳定。在这种条件下，RNA会同它的双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的RNA-DNA，而被取代的另一条DNA呈单链状态。这种由双链RNA-DNA和单链DNA形成的泡状体称R-环结构。,（3）电镜作图检测法,变性作图：用于DNA分子中AT丰富区段的鉴定，变性区段形成的特殊“泡”状精细结构。异源双链定位法：异源双链间同源序列及非同源区序列同源性区段。R-环检测法：用于鉴定双链DNA分子中含有与特定RNA分子同源区段。,（4）质谱分析法,某些生物（重组子）的基因组中增加的外源基因得以表达后，其蛋白质组中必将呈现额外的蛋白质，可按凝胶电泳作初步鉴定。为了进一步准确鉴定，可采用蛋白质双向凝胶电泳和质谱分析技术，如出现外源基因表达的蛋白质，基本上就可以确定待分子的材料是重组子。,1筛选植物转化细胞常用的报告基因有哪些。2筛选哺乳动物转基因细胞的遗传选择标记有哪些。,自动测序仪测序法(ABI),自动测序仪基于2，3-双脱氧末端终止法的原理，标记系统由放射性核素改为发特定荧光信号的荧光染料，预先将四种荧光染料与四种双脱氧核苷三磷酸共价相连，使其带有不同的荧光标记。当某一种ddNTP掺入到正在合成的DNA单链分子中时，该链的延伸便终止并带有相应的荧光染料。自动测序系统包括电泳分离系统、荧光检测装置、计算机成像系统及分析软件组合。,6,自动化测序法,Prober等1987年将链终止法加以改进，并与电子计算机程序的自动化技术相结合，加快了序列测定，并且不用放射性同位素标记脱氧核苷酸，避免了放射线对操作者的危害。,实际做法：在每种脱氧核苷酸上分别都以共价键接上不同荧光染料，然后与四种三磷酸核苷在同一器皿中，依照上述链终止法条件进行，即会复制出一系列不断增加较长一点的多聚脱氧核苷酸链，其3末端都各自带有特色荧光染料的双脱氧核苷酸，为了测定序列，将反应混合物在一条道上进行凝胶电泳，结果这条道上出现一系列有荧光的带。,这些有荧光的带中每一条都代表一个碱基在复制链中所在的位置。凝胶荧光测定体系由电子计算机控制。这个体系是用激光激发不同颜色的染料所发生的荧光，用短波长的蓝光及长波长的红光分别测量荧光强度之比值，测定在复制链中各碱基的位置，从而得到DNA的序列。熟练的操作者用这种