03生物信息传递(上)-2009-3-4.ppt

第三章生物信息的传递（上）从DNA到RNA,基本概念参与转录起始的关键酶与元件转录的基本过程转录后加工RNA的编辑、RNA的再编码及RNA的化学修饰原核生物与真核生物mRNA的特征比较,Contents,遗传信息传递的中心法则,生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。,中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。,一、基本概念,定义：生物体以DNA为模板合成RNA的过程。,1、转录(transcription)：,参与转录的物质,原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶其他蛋白质因子,RNA合成方向：53,2、转录的不对称性：,在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。,3、编码链与模板链:,编码链(codingstrand)：又称有义链，与mRNA序列相同的那条DNA链。(mRNA:TU)模板链(templatestrand)：又称反义链，一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链。,转录示意图,模板链并非永远在同一条单链上。（因子有选择模板链的作用。）,4、结构基因：DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。原核生物：约1000bp真核生物：约10000bp（含有大量的非编码序列。）,5、转录单元（transcriptionunit）,转录单元：一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。启动子：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。终止子：染色体上提供终止信号而使转录终止的一段核苷酸短序列。,二、参与转录起始的关键酶与元件,（一）RNA聚合酶每个细胞中约有7000个RNA聚合酶分子，时刻都有约2000-5000个RNA聚合酶分子在执行转录。,原核生物RNA聚合酶（大肠杆菌为例）,全酶=核心酶+因子全酶：起始因子，负责模板链的选择和转录。（别构效应物）核心酶：（核心酶只催化链的延长，对起始无作用。）,大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析,RNA聚合酶：催化性质,四种核苷三磷酸（ATP、GTP、CTP、UTP）为底物；模板以双链状态下活性最大；聚合酶无校对功能；转录时双链局部解开，新生RNA链与模板链形成杂螺旋，转录结束后，DNA双螺旋恢复，RNA释放。,真核生物RNA聚合酶,真核细胞的三种RNA聚合酶特征比较,RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别,（二）启动子(promoter),定义：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。,1、原核生物启动子结构,Pribnow,41-44bp,利用足迹法（footprint）和DNA测序法可以确定启动子的序列结构.足迹法即是将DNA起始转录的限制性片段分离后，用RNA聚合酶与之结合，再用DNA酶部分水解。与酶结合的部位被保护而不被水解，其余部分被水解成彼此只相差一个核苷酸的大小不等的片段，经凝胶电泳可测得酶结合部位的的序列结构。,附：测定启动子序列的方法,足迹法示意图,TATA区：酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开，并决定转录起始位置）。（-10区,Pribnow区）TTGACA区：提供了RNA聚合酶全酶识别的信号。（-35区，与RNA聚合酶全酶结合有关，以及与启动子的强弱活性有关。）,（1）原核生物启动子的结构,原核生物启动子,大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区,T85T83G81A61C69A52,T89A89T50A65A100,典型原核生物启动子的结构,-35-10转录起点TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp,（2）两类启动子突变：下降突变（downmutation):降低其结构基因转录水平的启动子突变。如在细菌中，把pribnow区的TATAAT变成AATAAT就大大降低其结构基因的转录水平。上升突变（upmutation):提高其结构基因转录水平的启动子突变。如在乳糖操纵子中，将pribnow区从TATGTT变成TATATT，就会提高启动子的效率，提高乳糖操纵子基因的转录水平。,2、真核生物启动子,真核有三种不同的启动子和有关的元件启动子最为复杂，它和原核的启动子有很多不同,真核生物启动子的结构,核心启动子（corepromoter）上游启动子元件（upstreampromoterelement，UPE）,（1）、核心启动子,定义：指保证RNA聚合酶转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区。（Hogness区）,作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始。（DNA双链开始解开）,TATA常在-25bp左右，相当于原核的-10序列T85A97T93A85A63A83A50,（2）、上游启动子元件定义：TATA区上游的保守序列，称为上游启动子元件。,包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等,作用：控制转录起始频率。,CAAT：-70-80bp，与RNA聚合酶的结合有关。（转录因子CTF识别位点并与之结合，激活转录。）GGGCGG：-80-110bp，与某些转录因子（如SP因子）结合有关。（SP1有锌指区可以与DNA结合，在N端有激活转录的作用）,（三）增强子增强子（Enhancer）包括启动子上游或下游的一段DNA序列，可以增强启动子发动转录，提高转录效率。其特点：远距离效应;无方向性;有组织特异性等。,首先被发现的增强子是SV40增强子。两个增强子位于基因组的两个串连的72nbp重复中，约在转录起始点上游200bp处，每个72bp重复中有一个。缺失实验显示两个重复缺失一个并不产生什么影响，而如两个均缺失即将大大降低活体内的转录。有人发现，如果将珠蛋白基因放在含有72bp重复的DNA分子中，它的转录作用在活体内将增高约200倍以上，甚至当此72bp顺序位于离转录起点上游1400bp或下游3000bp时仍有作用。各个基因中的增强子顺序差别较大，但有一个基本的核心顺序(coresequence)：AAAGGTGTGGGTTTGG,（四）转录起始复合物,原核生物转录起始复合物,三元起始复合复合物：RNA聚合酶DNA新生RNA,转录因子转录复合体TBP或TFIIDTAFsTFIIATFIIBTFIIFPolIITFIIERNApol的转录起始,真核生物转录起始复合物,真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启动子区，需要一些被称为转录调控因子的辅助蛋白按特定顺序结合于启动子上，RNA聚合酶才能与之结合并形成复杂的转录起始复合物，以保证有效的起始转录。,三、转录的基本过程（以大肠杆菌为例）,1、模板识别RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。,2、转录起始,转录起始：RNA链上第一个核苷酸键的产生。转录起点：与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基。转录起始过程：RNA聚合酶与启动子DNA双链结合形成三元起始复合物（RNA聚合酶-DNA-新生RNA）。（具体同前）,转录起始不需要引物。转录起始位点的模板链常为CAT，RNA的第一个碱基通常为嘌呤，ATP/GTP）。通过启动子阶段：转录起始后直到形成9个核苷酸短链的过程。,3、RNA链的延伸,亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。注：大肠杆菌RNA聚合酶的活性一般为50-90个/秒。转录与翻译的速度基本相等，2500个核苷酸/min，（14个密码子/S，15AA/s)。,核心酶DNARNA,4、转录终止,终止子（terminator）强终止子内部终止子（不依赖Rho()因子的转录终止。）弱终止子需要因子（rhofactor）又称为依赖性终止子（Rho-dependentterminator）,（）强终止子不依赖因子的终止,终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，RNA形成发夹结构。,在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，RNA的3端为寡聚U。,发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。,终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，长度效率,（）弱终止子依赖因子的终止,因子：六聚体蛋白、水解各种核苷三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。,转录的基本过程,5、转录产物：经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA和hnRNA等。,其他RNA：snRNA：核内小分子RNA，mRNA加工剪接和成熟。snoRNA:核仁小分子，rRNA的切割和修饰。asRNA:反义RNA，抑制RNA的加工与翻译，是原核基因表达的一种重要调控方式。dsRNA:双链RNA，可诱发与该RNA高度同源的基因序列的特异性“沉默”。siRNA：小分子干扰RNA，由细胞中较长的外源双链RNA（30个核苷酸以上）降解而成，特异地降解目标mRNA。（介导RNAi技术，即RNA干涉技术）miRNA:微RNA,内源性(细胞发育过程中产生),降解mRNA.,6、转录的抑制剂,（1）RNA生物合成的抑制剂（之一）：模板抑制剂,烷化剂：使DNA发生烷基化，发生在G-N7，A-N1、N3N7；C-N1。易引起嘌呤的水解，在DNA上留下空隙干扰复制或转录；或引起碱基错配。放线菌素D：放线菌素D与DNA形成非共价的复合物，真核和原核生物RNA聚合酶的专一抑制剂,抑制其模板功能（低浓度抑制转录，较高浓度抑制复制）。具有类似作用的还有色霉素A3、橄榄霉素、光神霉素。嵌入染料：可插入双链DNA分子相邻的碱基对之间，一般具有芳香族发色团。溴化乙锭（EB）是一种高灵敏的荧光试剂，常用来检测DNA和RNA。与DNA结合后抑制其复制和转录。,（2）RNA生物合成的抑制剂（之二）：,作为代谢拮抗物抑制合成酶类或直接掺到核酸分子中，形成异常RNA或DNA。,（3）RNA聚合酶抑制剂（之三）：RNA聚合酶抑制剂,利福霉素：抑制细菌RNA聚合酶活性。利福平可以高效抑制结核杆菌，杀死麻疯杆菌，在体外有抗病毒作用。利链霉素：与细菌RNA聚合酶亚基结合，抑制转录过程中RNA链的延长反应。-鹅膏蕈碱：抑制真核生物RNA聚合酶活性。,附：部分毒菇图片,大鹿花菌,赭红拟口菇,毒鹅膏菌,白毒鹅膏菌,毒蝇鹅膏菌,细环柄菇,大青褶伞,红褐鳞蘑菇,毛头鬼伞,半卵形斑褶菇,四、转录后加工,5端加帽3端加尾RNA的剪接RNA的编辑RNA的再编码RNA的化学修饰,5端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5端的这种结构称为帽子（cap）。,1、在5端加帽,（1）5端形成特殊的帽子结构，有三类：帽子0：m7GpppX单细胞生物（如酵母）帽子1：m7GpppXm多细胞生物，主要形式帽子2：m7GpppXmpYm占10-15%,m7Gppp,鸟苷酸转移酶,（2）帽子结构功能：能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合；m7Gppp结构能有效地封闭mRNA5末端，以保护mRNA免受5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。,2、3-端加尾,多聚腺苷酸尾巴,AAUAAA：准确切割加poly（A）,多聚腺苷酸尾巴功能：提高了mRNA在细胞质中的稳定性。,3、RNA的剪接,内含子剪切异常可引起疾病，如地中海贫血病人的珠蛋白基因，1/4,（1）mRNA前体的主要剪接方式:（类)，即GU-AG法则,又称Chambon法则。,参与RNA剪接的物质：snRNA（核内小分子RNA）snRNP（与snRNA结合的核蛋白）,5.AAGUAAGU.CURAY.(10-40)(U/C)11NCAGG.3,Intron,exon,exon,Polyprimidine,前一位核苷酸可影响剪接效率：CAG=UAGAAGGAG,剪接的过程：,U1snRNA含与内含子-端互补序列,U2snRNA含与分支处互补序列,（）类内含子的自我剪接（如四膜虫、细菌）,借助与鸟苷酸或鸟苷的作用，内含子自我催化，通过两次转酯反应完成拼接。,（）类内含子的自我剪接（主要存在于真核生物的线粒体和叶绿体的rRNA基因）,也是由内含子自我催化完成，但转酯反应无鸟苷的参与，两次转酯反应后内含子形成套索结构而切下。,附：RNA拼接的意义,RNA拼接现象的发现，给生物学家一系列令人困惑的疑问：为什么生物机体要先转录内含子，然后将其切除？RNA合成后再拼接是一个非常耗能的过程，对细胞其收益是什么？内含子由何而来？内含子有无生物功能？围绕以上问题，提出一些看法或观点，但争议很大，目前尚无定论：,RNA的拼接是生物机体在进化历史中形成的，是进化的结果；RNA的拼接是基因表达的重要环节。RNA转录后通过拼接而抽取有用信息，形成连续的编码序列，并可通过选择性拼接而控制生物机体生长发育。因此，这是真核生物遗传信息精确调节和控制的方式之一。,基因由模块装配而成，模块间的间隔序列也就演变成内含子，因此外显子和内含子有着同样的古老历史。而现今存在的几类内含子也各自有其起源和进化历史，从它们的拼接方式和分布可以大致推测其起源时间。RNA的拼接主要存在于真核生物，原核生物极为少见，但并非完全没有。一种合理的解释是原核生物为适应快速生长的需要，在进化中已将内含子丢掉。事实上，快速生长的单细胞如酵母，其编码的基因也几乎没有内含子。然而内含子的存在和拼接作用对生物机体的进化十分重要。内含子和外显子是相对的，有些内含子具有编码序列，能产生蛋白质和功能RNA。,五、RNA的编辑、RNA的再编码、RNA的化学修饰和核酶,1、RNA的编辑（）定义RNA的编辑（RNAediting）是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、添加或缺失等现象。,C变为U,（2）编辑机制：碱基的突变,尿苷酸的缺失和添加,1986.R.Benne在研究锥虫线粒体mRNA转录加工时发现mRNA的多个编码位置上加入或丢失尿苷酸，1990年在高等动物和病毒中也发现了编辑现象。,锥虫coxII基因的编辑,2、RNA的再编码,(1)定义：把RNA编码和读码方式的改变称为RNA的再编码（RNArecoding)。(2)RNA再编码的主要表现：核糖体程序性+1/-1移码核糖体跳跃终止子通读,3、RNA的化学修饰,(1)转录产物的化学修饰对象：前体rRNA和tRNA(2)参与rRNA化学修饰的物质：70100个核苷酸的核仁RNA（snoRNA),一般认为，snoRNA上的D盒是甲基化酶的识别位点.(3)化学修饰的主要类型:甲基化、去氨基化、硫代、碱基的同分异构等。,4、核酶（ribozyme）,(1)核酶定义核酶：具有催化功能的RNA为核酶。（一般不需与蛋白质结合，是一种金属依赖酶，如Mg2+）1981年CechT在研究四膜虫(Tetrahymenathermophila)rRNA前体拼接过程中发现，此类的拼接无需蛋白质的酶参与作用，它可自我催化完成。1989年cechT和AltmanS共同获诺贝尔化学奖，AltmanS的贡献是发现RnaseP中的M1RNA单独也具有催化功能。核酶的发现改变了酶的化学本质是蛋白质的传统观念，被认为是近二十年来生物化学领域中最令人鼓舞的成就之一。,（2）核酶的类型核酶的催化活性有剪接酶、核苷酸转移酶、RNA限制性内切酶、磷酸转移酶和磷酸酯酶等多种酶活性。可分为两类：剪接型核酶：是指RNA被磷酸二酯酶水解、切割后，伴随形成新的磷酸二酯键，也即磷酸二酯键的转移。该酶具有特异核酸内切酶、RNA连接酶等多种酶活性。如类内含子和类内含子、四膜虫rRNA前体等。剪切型核酶：只剪不接。如M1RNA（RNaseP，在高浓度Mg2+存在时，特异性地剪切tRNA前体，端片段。）、锤头核酶、发夹核酶、丁型肝炎病毒（HDV)核酶、T4噬菌体的RNA前体、四膜虫rRNA前体剪接产物L19（RNA）等。,（3）核酶的结构“锤头结构”（hammerheadstructure)，具有一个由11-13个保守核苷酸构成的催化中心。,（4）核酶的应用核酶抗肝炎病毒的研究目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）以及HDV作用的研究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶。抗人类免疫缺陷病毒型（HIV-)核酶1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV-基因表达，并率先进入临床期。抗肿瘤治疗核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。另外，利用核酶防治动、植物病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆等。,（5）核酶技术面临的问题核酶催化切割反应的可逆性问题提高催化效率寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞使核酶在细胞内有调控地高效表达增强核酶在细胞内的稳定性对宿主的损伤问题有待进一步考察,补充：脱氧核酶,（一）概念脱氧核酶（deoxyribozyme）是利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。（二）脱氧核酶的发现1994年，Gerald.F.Joyce等报道了一个人工合成的35bp的多聚脱氧核糖核苷酸能够催化特定的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸形成的磷酸二酯键，并将这一具有催化活性的DNA称为脱氧核酶或DNA酶（DNAenzyme,DE）。,1995年，Cuenoud等在Nature报道了一个具有连接酶活性的DNA，能够催化与它互补的两个DNA片断之间形成的磷酸二酯键。迄今已经发现了数十种脱氧核酶。尽管到目前为止，还未发现自然界中存在天然的脱氧核酶，但脱氧核酶的发现仍然使人类对于酶的认识又产生了一次重大飞跃，是继核酶发现后又一次对生物催化剂知识的补充。这将有助于了解有关生命的一个最基本问题，即生命如何由RNA世界演化为今天的以DNA和蛋白质为基础的细胞形式。这项发现也揭示出RNA转变为DNA过程的演化路径可能也存在于其它与核酸相似的物质中，有助于了解生命基础结构及其进化过程。,（三）脱氧核酶的分类根据催化功能的不同，可以将脱氧核酶分为5大类：切割RNA的脱氧核酶、切割DNA的脱氧核酶、具有激酶活力的脱氧核酶、具有连接酶功能的脱氧核酶、催化卟啉环金属螯合反应的脱氧核酶。其中以对RNA切割活性的脱氧核酶更引人注意，不仅能催化RNA特定部位的切割反应，而且能从mRNA水平对基因进行灭活，从而调控蛋白的表达。（四）脱氧核酶的研究展望对于脱氧核酶的研究有望成为基因功能研究、核酸突变分析、治疗肿瘤、对抗病毒及肿瘤等疾病的新型基因治疗药物的新型核酸工具酶。,六、原核生物与真核生物mRNA的特征比较,1、原核生物mRNA的特征半衰期短多以多顺反子的形式存在,多顺反子mRNA：编码多个蛋白质的mRNA。,单顺反子mRNA：只编码一个蛋白质的mRNA。,结构基因,Z：-半乳糖苷酶Y：透过酶A：乙酰基转移酶,5端无“帽子”结构，3端没有或只有较短的poly（A）结构。,SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。,2、真核生物mRNA的特征,5端存在“帽子”结构,多数mRNA3端具有poly（A）尾巴（组蛋白除外）,以单顺反子的形式存在,“基因”的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。,原核生物和真核生物mRNA结构的比较,补充：原核生物与真核生物基因转录的差异,原核生物只有一种RNA聚合酶负责转录所有类型的基因，而真核生物有三种以上的RNA聚合酶，负责不同基因类型的转录，合成不同类型的RNA，在细胞核内的位置也不同。转录产物的差异。真核生物的初始产物很长，包含有内含子序列，成熟mRNA其中的小部分。而原核生物的初始产物大多数为编码序列，与蛋白质序列成线性关系。,真核生物转录产物经历加工、修饰过程，即内含子剪切，5，端加帽和3，多聚A化。与基因结构相吻合，原核生物mRNA是多顺反子；而真核生物的大多数是单顺反子结构。原核细胞中，转录产物直接可以成为蛋白质合成的模板，因而一边转录合成mRNA，一边合成蛋白质。注：原核生物的其他各类RNA仍以前体的方式合成，然后加工成成熟的rRNA、tRNA等。,七、RNA合成与DNA合成异同点,（1）相同点：1、都以DNA链作为模板2、合成的方向均为533、聚合反应均是通过核苷酸之间形成的3,5-磷酸二酯键，使核苷酸链延长。,（2）不同点：,八、RNA生物功能的多样性,1、RNA在遗传信息的翻译中起着决定作用。2、RNA具有重要的催化功能和其他持家功能。3、RNA转录后加工和修饰依赖于各类小RNA和其他蛋白质复合物。4、RNA对基因表达和细胞功能具有重要调节作用。5、RNA在生物进化中起重要作用。,中国科学院2001年硕士研究生入学考试：名词解释：Transc