色谱知识介绍.ppt

,HPLC色谱知识及应用,反相分配色谱极性:固定相流动相固定相-极性流动相(己烷,庚烷)-非极性极性物质后出峰,正相色谱20%,反相色谱80%,正相&反相色谱,硅胶基质-pH38Al2O3.nH2O-pH114聚合物基质-pH114,高或低pH下,硅胶会溶解,化学修饰困难,孔结构复杂,孔径不均匀导致柱效不够高,有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损,柱填料基质,硅胶纯度填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸填料床的长度和内径颗粒形状球型或不规则型粒径平均颗粒直径,通常3-10m表面积颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/gram表示孔径颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300,色谱柱物理性质,C-18柱-性能影响因素,键合类型单体键合-键合相分子与基体单点相连聚合体键合-键合相分子与基体多点相连碳覆盖率键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，也可以用覆盖度来表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。封端键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来,色谱柱化学性质,C-18柱-性能影响因素,A类硅胶OriginalZORBAXSIL(1970s)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高(硅羟基的pKa低),导致碱性化合物发生拖尾,B类硅胶(高纯)ZORBAXRx-Sil(1987)由于金属含量低,硅羟基pKa高,碱性化合物不发生拖尾,C-18柱-性能影响因素,色谱柱尺寸-对色谱分离的影响短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长窄径柱(2.1mm)-检测器灵敏度高宽径柱(3-21.2mm)-载样量高,C-18柱-性能影响因素,颗粒形状-对色谱分离的影响当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时,球型颗粒可以降低柱压,延长色谱柱寿命,C-18柱-性能影响因素,球形,不规则形,粒径-对色谱分离的影响较小的颗粒柱效较高,但会引起柱压过高.3.5m粒径的常用于分离复杂的多组份样品,而组份单一的样品多采用5m的粒径,1.8m3.55m7m10m,表面积-对色谱分离的影响高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力,柱容量和分离度.表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态,对于梯度淋洗尤为重要,C-18柱-性能影响因素,孔径-对色谱分离的影响大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间,达到充分分离,改善峰形样品MW4,000,选择80的孔径样品MW4,000,选择300的孔径,键合类型-对色谱分离的影响单齿键合：提高传质速率,加快色谱柱平衡双齿键合：增加色谱柱稳定性,增加色谱柱的载样量,C-18柱-性能影响因素,碳覆盖率-对色谱分离的影响高碳覆盖率：提高分辨率,分析时间长低碳覆盖率：缩短运行时间,封端-对色谱分离的影响封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品,未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异,C-18柱-性能影响因素,固定相键合二甲基硅烷,封端四甲基硅烷,Si,O,OH,O,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,R=C8,C18,etc,.,O,OH,OH,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,+,+,Cl,CH,3,Si,CH,3,CH,3,OH,OH,OH,OH,CH,3,Cl,R,CH,3,(,TMS),传统键合及封端技术,键合相种类,化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。极性键合相：氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)常用作正相色谱，极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。非极性键合相：各种烷基(C1C18)和苯基、苯甲基，极性弱的组分保留值较大。,HPLC-色谱柱与pH的关系,（可用于100%全水相）,未封端,双封端,三封端,双封端,HPLC-保留值与pH的关系,pH变化值0.1,RS变化值1.6,色谱柱：ZorbaxStableBondC184.6X250mm,5um流动相：27%甲醇：73%磷酸pH2.5&2.6温度：500C流速：1.0mL/min.,邻氯苯胺（pKa2.636),色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C84.6x75mm,3.5m流动相:44%25mM磷酸,pH7.00:56%甲醇流速:1.0mL/min温度:25C检测:UV250nm,可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化甚至很小的0.050.25个pH变化单位.,样品:ketoprofenethylparabenHydrocortisonefenoprofenpropylparabenPropranolol(游离碱pka9.5）ibuprofen,HPLC-保留值与pH的关系,0.25个pH,HPLC-保留值与pH的关系,pH变化：0.2个pH(7.07.2)保留时间改变：1.2分钟(13.614.8分钟),保留时间随pH改变不明显,保留时间随pH改变不明显(酸性环境中),（PKa：2.98）,（PKa：10.1）,方法稳定区方法波动区(pKa+1.5)方法稳定区,HPLC-保留值与pH的关系,复杂组分的流动相pH选择技巧,色谱柱:ZORBAXExtend-C184.6x150mm,5mm流动相:30%缓冲液:70%MeOHpH7缓冲液20mMNa2HPO4pH11缓冲液20mMTEA流速:1.0mL/min温度:RT检测器:UV254nm,05,1,2,3,4,5,Time(min),7,6,Extend-C18pH7,1.Maleate马来酸盐2.Scopolamine东莨菪碱pKa7.63.PseudoEphedrine假麻黄碱pKa9.84.Doxylamine抗敏安(多西拉敏)pKa9.25.Chlorpheniramine氯苯吡胺pKa9.16.Triprol内径ine苯丙烯啶pKa6.57.Diphenhydramine苯海拉明pKa9.0,Extend-C18pH11,0510,1,2,3,4,Time(min),6,5,7,高pH下,碱性成分的保留增加,待测物pKa+1.5以外的流动相pH可保证方法的稳定性,样品溶剂溶解强度,样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰或宽峰,中性分析时为何要使用缓冲液？,色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C8,4.6x75mm,3.5m流动相:44%A:56%甲醇流速:1.0mL/min温度:25C检测:UV250nm,含缓冲液的流动相可改善保留,分离和色谱峰峰形.,样品:1.pranolol7.ibuprofen,A=pH7.0水,A=pH7.0水+25mM磷酸缓冲液,增加缓冲液浓度减少拖尾,色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C84.6x150mm,5mm流动相:40%磷酸盐缓冲液60%ACN流速:1.5mL/min.温度:40C,USPTf1.621.651.631.771.831.12,10mM磷酸盐pH7.0,USPTf1.411.501.331.391.361.00,25mM磷酸盐pH7.0,在中等pH下,离子强度较高,能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾,样品:TricyclicAntidepressants（三环抗抑郁剂）1.Desipramine（脱甲丙咪嗪）2.Nortriptyline（去甲替林）3.Doxepin（多塞平）4.Imipramine（丙咪嗪）5.Amitriptyline（阿米替林）6.TrImipramine（三甲丙咪嗪）,三乙胺对碱性成分峰形的影响,02.55.0,Time(min),1,2,3,4,5,色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C8,4.6x150mm,5mm流动相:85%25mMNa2HPO4:15%ACN流速:1.0mL/min.温度:35C,USPTF5%1.1.292.1.333.1.634.2.355.1.57,No三乙胺,10Mm三乙胺,USPTF5%..265.1.14,pH7,样品:1.Phenylpropanolamine（去甲麻黄碱）2.Ephedrine（麻黄素）3.Amphetamine（苯丙胺）4.MethAmphetamine（脱氧麻黄碱）5.Phenteramine（苯丁胺）,竞争酸对酸性组分的峰形的影响,色谱柱:ZORBAXStableBondSB-C184.6x150mm,5mm流动相:40%A:60%ACN流速:1.0mL/min.温度:室温样品:Ibuprofen（异丁苯丙酸）pKa4.4,pH35mMNaH2PO4,Tf=1.8,pH35mMNaH2PO41%乙酸,pH2.55mMNaH2PO40.1%三氟乙酸,Tf=1.0,Tf=1.09,A:,乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中三氟乙酸由于所需浓度较低,可作为首选,液相分析-小诀窍,提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）改变流动相pH，可增加柱效（提高灵敏度）改变有机相%，可增加柱效（提高灵敏度）改变键合相，可增加柱效（提高灵敏度）改变有机添加剂，可增加柱效（提高灵敏度）改变流动相配比方式，可增加柱效（提高灵敏度）,样品:除草剂流动相:52/480.1M乙酸钠/甲醇,pH6流速:0.45mL/min温度:40,90检测:UV,柱温的影响,1.西玛津2.敌草隆3.扑灭津4.扑灭净5.异丙甲草胺,液相色谱柱:ZorbaxStableBond-C18色谱柱尺寸:4.6x150mm,5m,40,90,提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）,液相色谱柱:ZorbaxStableBond-C8色谱柱尺寸:150mm,5m,减小毛细管内径来提高低浓度样品的检测灵敏度,流动相:60%乙腈/40%水流速:内径0.3mm-4uL/min内径0.5mm-10uL/min内径1.0mm-50uL/min内径4.6mm-1.0uL/min温度:室温检测器:UV254nm样品:200ng联二苯(100nl),减小柱径，可增加柱效（提高灵敏度）,色谱柱使用小体积色谱柱对于检测器响应时间的重要性(TE32),液相色谱柱:ZORBAXStableBond-C18色谱柱尺寸:4.6x15mm3.5m,流动相:乙腈:1%甲酸=32:68UV:254nm流速:1.0mL/min.30C进样量:5L,响应时间:4.0秒响应时间:2.0秒响应时间:1.0秒响应时间:0.5秒响应时间:0.1秒,尿嘧啶乙酰水杨酸N-乙酰苯胺,缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）,色谱柱不同硅胶类型比较(TE1),流动相:含0.05%甲醇的二氯甲烷,液相色谱柱,ZorbaxSilSpherisorbZorbaxRx-Sil,甲苯N-苯甲酰苯胺苯酚苯甲醇,使用高纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）,pH对苯胺取代物分析的影响,流动相25mM磷酸:甲醇=58:42流速:1mL/min22C,液相色谱柱:ZORBAXStableBond-C18色谱柱尺寸:4.6x150mm5m,对位甲氧基苯胺间位苯甲胺(苯甲胺PKb=9.15)3-氨基-苯甲腈对位氯苯胺间位氯苯胺邻位氯苯胺（pka=2.636）,pH:2.5pH:7.0,改变流动相pH，可增加柱效（提高灵敏度）,三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响(B10),流动相:A:水和三氟乙酸B:乙腈和三氟乙酸0-30%B（30min.内）流速:1mL/minUV:254nm进样量:6uL十肽菌素标样S1-S5（疏水性有略微差异）40C,液相色谱柱:ZORBAX300SB-C8色谱柱尺寸:4.6x150mm5m,1.0%三氟乙酸,0.05%三氟乙酸,0.25%三氟乙酸,改变流动相pH，可增加柱效（提高灵敏度）,有机改性剂和pH对于选择性的影响,流动相:25mM磷酸缓冲液流速:1.0mL/min.22C,液相色谱柱:ZORBAXStableBond-CN色谱柱尺寸:4.6x150mm5m,甲氧基苯胺间位苯甲胺4-氯-苯胺3-氨基苯甲腈3-氯-苯胺2-氯-苯胺,42%甲醇：58%缓冲液30%甲醇：70%缓冲液,pH2.6,pH3.0,改变有机相%，可增加柱效（提高灵敏度）,色谱柱的选择性,液相色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-Phenyl色谱柱尺寸:4.6x150mm5m,流动相:甲醇:水=70:30UV:254nm流速:1.0mL/min.室温,ZorbaxEclipseXDB-苯基ZorbaxEclipseXDB-C8ZorbaxEclipseXDB-C18,尿嘧啶苯酚4-氯-硝基苯甲苯萘,改变键合相，可增加柱效（提高灵敏度）,流动相对色谱的影响,液相色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C8色谱柱尺寸:4.6x50mm3.5m,UV:254nm流速:1mL/min.室温,尿嘧啶尼帕尔金丁酯萘二丙基邻苯二甲酸酯苊,刻度混合:Dial-a-MixA:水B:甲醇,用泵抽取50%B,体积比混合:Vol/Vol250mL水+250mL甲醇,用泵抽取100%混合液,定容混合:Mix-to-Mark250mL甲醇,用水定容至500mL,用泵抽取100%混合液,预