第三章临床生物化学检验常用技术.ppt

1,常用生物化学检验技术（上）,第三章,2,第一节光谱分析技术第二节电化学分析第三节干化学分析技术第四节电泳技术第五节层析技术第六节离心技术第七节自动生化分析技术,本章内容概要,3,第一节光谱分析技术,光谱分析技术的基本原理,光谱分析技术在临床生物化学检验中的应用,光谱分析技术的影响因素,4,光谱分析技术原理：,利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。,光谱分析技术分类：,发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法,吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光度法和红外光谱法,散射光谱分析技术：比浊法,5,一、光谱分析技术的基本原理,（一）可见及紫外分光光度法的基本原理,A=-lgT=-lgI/I0=lgI0/I,1.吸光度与透光度当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即：,T=I/I0,T100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即：,6,7,8,9,10,2.Lambert-Beer定律,Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其表达式为：,A=KLC,式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度,（Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）,11,12,据Lambert-Beer定律，当液层厚度为cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数()。的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时在特定波长下的吸光度值。是物质的特征性常数。,13,（二）原子吸收分光光度法的基本原理,原子吸收分光光度法是基于元素所产生的原子蒸气中待测元素的基态原子，对所发射的特征谱线的吸收作用进行定量分析的一种技术。,14,（三）荧光分析法的基本原理,利用荧光强度进行分析的方法，称为荧光法。在荧光分析中，待测物质分子成为激发态时所吸收的光称为激发光，处于激发态的分子回到基态时所产生的荧光称为发射光。荧光分析法测定的是受光激发后所发射的荧光强弱。,15,16,（四）火焰光度法的基本原理,火焰光度法是利用火焰中激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析的方法。样品中待测元素激发态原子的发射光强度与该元素浓度呈正比关系。,17,（五）透射和散射光谱分析法的基本原理,主要测定光线通过溶液混悬颗粒后的光吸收或光散射程度。临床上多用于对抗原或抗体的定量分析。,18,二、光谱分析技术在临床生物化学检验中的应用,（一）定性分析,定性依据：,最大吸收波长max和摩尔吸光系数,2.摩尔消光系数方法,1.最大吸收波长max方法,19,20,（二）定量分析,1.标准曲线法,根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，按最小二乘法的原理，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。,方法：,21,22,23,制作和应用标准曲线时应注意下面几点：,（1）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘制。,（2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。,（3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。,（4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。,24,2比较法,Cu=(AuCs)/As,己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：,其中Cu和Au为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量和标本管浓度相近。,25,3标准加入法,把待测样本分成体积相同的若干份，分别加入不同量的标准品，然后测定各溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准品加入量为横坐标，绘制标准曲线，用直线外推法，使工作曲线延长交横轴，找出组分的对应浓度。本法的优点是能够更好地消除样品基质效应的影响。,26,27,4.内标法,在系列标准品和未知样品中加入一定量样品中不存在的元素（内标元素），分别进行测定。以标准品与内标元素的比值为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，再根据未知样品与内标元素的比值依曲线计算出未知样品的浓度。本法要求内标元素应与待测元素有相近的物理和化学性质。,28,29,三、光谱分析技术的影响因素,1.光学因素Lambert-Beer定律要求入射光是单色光入射光的谱带越宽，其误差越大。2.化学因素浓度、pH、溶剂和温度等因素可影响化学平衡,30,第二节电化学分析技术,电化学分析技术的基本原理,电极分析法在临床检验中的应用,离子选择电极的分析方法,样品测定方式,31,一、电化学分析技术的基本原理,电化学分析技术是利用物质的电化学性质，测定化学电池的电位、电流或电量的变化进行分析的方法。分类：电位法电阻法电容量分析法,32,离子选择电极是电位分析中的一类指示电极，由特殊敏感膜制成，它作为电化学传感器，对溶液中某种特定离子具有选择性响应，在一定范围内，其电位与溶液中特定离子活度的对数呈线性关系。,33,34,1.离子选择电极(ISE)基本结构,由电极管、内电极、电极内充溶液和电极膜（敏感膜）四个部分组成。ISE电极膜和电极内充溶液均含有与待测离子相同的离子；膜的内表面与具有相同离子的固定浓度电极内充溶液接触，其中插入一内电极，膜的外表面与待测离子接触。,35,36,2.电极电位,大多数电极膜电位的产生是基于膜材料与溶液界面发生的离子交换反应。当电极置于溶液中时，由于离子交换和扩散作用，改变了二相中原有的电荷分布，因而形成双电层，其间产生一定的电位差即膜电位。,37,3.电极电位测量,由于单个电极电位的绝对值无法测量，必须将ISE与参比电极共同浸入待测样品中，组成一个原电池，通过测量原电池电动势来测定ISE电位。,38,39,二、电极分析法在临床检验中的应用,（一）常用的离子选择性电极按照膜电位的响应机制、膜的组成和结构特点，离子选择电极可分为基本电极和敏化电极。基本电极包括晶体膜电极（均相膜电极和非均相膜电极）和非晶体膜电极（刚性基质电极和流动载体电极），敏化电极包括气敏电极和酶电极。,40,1.玻璃膜电极,玻璃膜电极属于刚性基质电极。敏感膜由玻璃材料制成。最常见的玻璃膜电极为pH玻璃电极,41,42,2.气敏电极,气敏电极是基于界面化学反应对气体敏感而设计的一类敏化电极。它由指示电极、参比电极、透气膜和内电解质溶液组成，当气敏电极与待测溶液接触时，待测溶液中的气体能通过透气膜扩散到内电解质溶液中并建立新的平衡。,43,44,3.酶电极,酶电极是另一种敏化电极，其原理是将含酶的凝胶涂布于离子选择电极的敏感膜上，组成酶电极，当酶电极浸入溶液中，溶液中的待测物与酶接触产生化学反应，生成产物经凝胶层扩散至离子选择电极的敏感膜上，从而引起相应的电位变化，电极电位的变化与溶液中待测物的浓度成正比。,45,46,三、离子选择电极的分析方法,1.标准曲线法2.标准比较法3.标准加入法首先测定待测液的电动势，然后于这一体系中加入体积已知的标准溶液，再测定电动势，依照公式计算浓度：C=C/(antilgE/s-1),47,四、样品测定方式,1.直接法样品不经稀释直接由电极测量离子活度。2.间接法样品经一定离子强度缓冲溶液稀释后由电极测量离子活度。,48,第三节干化学分析技术,干化学分析技术的基本原理,干化学分析技术在临床检验中的应用,49,一、干化学分析技术的基本原理,干化学技术普遍采用多层膜固相试剂技术，测定方法多为反射光度法和差示电位法。,50,1.反射光度法,固相化学涉及的反射光度法主要为漫反射。当固相层厚度和固相反应层的散射系数固定时，光吸收系数同待测物的浓度成正比。在干片试剂中，多种反应试剂被固化在一张透明聚酯膜上，