RNA指导的DNA复制(逆转录)及病毒的复制

.,RNAreplication,Reversetranscription=replication,.,逆转录酶（reversetranscription),1964年，Temin发现Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制剂遏制。表明：RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中要合成DNA。Temin又发现放线菌素D能抑制致癌RNA病毒的复制，但不能抑制一般RNA病毒的复制。表明：转录对于RNA病毒增殖是必需的。,.,Temin提出前病毒假说：原病毒DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物。1970年，Temin在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中发现逆转录酶。,.,多功能酶：,1、RNA指导的DNA聚合酶活性2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解RNA-DNA杂交体上的RNA3、DNA指导的DNA聚合酶活性：合成互补DNA。4、没有35外切酶活性。,.,特点：,含有Zn2+（是否有锌指结构、DNA结合功能？）DNA合成反应要求有模板和引物。需适当浓度的二价阳离子（Mg2+、Mn2+）53合成方向,.,逆转录病毒的基因组复制过程,第一阶段：合成负股cDNA的大部分第二阶段：以负股DNA为模板合成一小部分正股DNA链。第三阶段：完成cDNA的全部复制。,.,.,.,.,乙肝病毒基因组的复制,其复制需通过逆转录过程经RNA中间体实现，其DNA聚合酶也是一种逆转录酶。,.,.,逆转录病毒：RNADNARNA乙肝病毒：DNARNADNA,.,试管内cDNA的合成,常用于获得或研究真核生物基因的方法。提取某一种特定的mRNA，经逆转录生成的cDNA可代表某一特定基因。常用的逆转录酶有两种：来自鸟类成髓细胞瘤逆转录病毒称为AMV-RT；来自鼠白血病毒称为MMLV-RT。,.,.,病毒RNA复制的主要方式,1、病毒含有正链RNA，如灰质炎病毒。RNA（+）蛋白质（酶）RNA复制2、病毒含有负链RNA和复制酶如狂犬病毒。RNA（-）RNA（+）蛋白质、复制病毒RNA（-）。3、病毒含有双链RNA和复制酶。如呼肠孤病毒。双链RNARNA（+）蛋白质RNA（-）双链RNA4、逆转录病毒。,.,讨论题,如何知道DNA复制中先要有RNA引物的合成？(原料/新合成DNA序列分析/专一核酸酶水解),.,病毒的复制,病毒在活细胞内，以其基因为模板，在酶的作用下，分别合成病毒基因及蛋白质，再组装成完整的病毒颗粒，这种方式称为复制（replication)。从病毒进入宿主细胞开始，经过基因组复制和病毒蛋白合成，至释放出子代病毒的全过程，称为一个复制周期。病毒的复制周期主要包括吸附和穿入、脱壳、生物合成、组装和释放四个连续步骤。,.,复制周期,.,病毒的一步生长曲线,病毒的一步生长曲线：以感染时间为横坐标，病毒效价为纵坐标，绘制出的病毒特征曲线。,.,一、吸附和穿入,（一）吸附(adsorption)分两个阶段：静电吸附：病毒体与细胞接触，进行静电结合。非特异性、可逆。真正的吸附：病毒体表面位点（蛋白质结构）与宿主细胞膜上相应的受体结合。是决定病毒感染的真正开始。,.,裸露病毒的吸附,.,囊膜病毒的吸附,.,（二）穿入(penetration)病毒体吸附在宿主细胞膜上后，可通过数种穿入方式进入细胞：,1.无囊膜的病毒一般经过细胞膜吞入，称为病毒胞饮,如腺病毒、小RNA病毒等,.,病毒胞饮,.,2.有囊膜的病毒囊膜与宿主细胞膜融合，病毒的核衣壳直接进入细胞浆内病毒胞饮:细胞膜吞入,.,(1)膜融合后进入,.,(2)病毒胞饮,.,二、脱壳(uncoating)不同病毒脱壳方式不一，多数在宿主细胞溶酶体酶作用下脱壳，释放出基因组核酸。,.,三、生物合成(biosynthesis),病毒基因组一旦从衣壳中释放后，就利用宿主细胞提供的低分子物质合成大量的病毒核酸和结构蛋白。早期，根据病毒基因组转录成mRNA、指令合成转录合成所必需的复制酶和一些抑制蛋白；生物合成阶段，病毒处于隐蔽期病毒的生物合成过程可基本归为6大类：双股DNA病毒、单股DNA病毒、单正股RNA病毒、单负股RNA病毒、逆转录病毒和双股RNA病毒。,.,.,病毒DNA,早期mRNA,早期蛋白（酶等）,子代病毒DNA,晚期mRNA,病毒结构蛋白,子代病毒子,双股DNA病毒,复制,宿主细胞转录酶,.,单链正股RNA病毒,（-）ssRNA,亲代病毒（+）ssRNA,早期蛋白,（+）ssRNA,dsRNA复制中间型,（-）ssRNA,（+）ssRNA,大量子代（+）ssRNA,晚期蛋白,装配子代病毒,.,单股负股RNA病毒,病毒自身携带依赖RNA的RNA多聚酶。,亲代（-ssRNA）,（+）mRNA,蛋白质,（+）ssRNA,子代（-）sRNA,子代病毒,多聚酶,.,逆转录病毒,.,四、组装,病毒核酸与衣壳装配在一起，形成病毒子。绝大多数DNA病毒均在细胞核内组装;RNA病毒和痘病毒在细胞浆内组装。,.,绝大多数无囊膜病毒释放，一次同步，破坏宿主细胞膜，细胞裂解释放病毒颗粒，细胞迅速死亡。绝大多数有囊膜病毒以出芽方式释出时包上细胞核膜或细胞膜而成为成熟病毒。逐个释出，非一次同步，细胞死亡缓慢。,五、释放,.,VirusObtainingItsEnvelopefromHostCellMembranebyBudding,.,复制周期,.,思考题1,某种病毒DNA的碱基组成（摩尔百分比）如下：A=32；G=16；T=40；C=12该病毒DNA的特点如何？,.,思考题2,简要说明怎样进行构建cDNA文库？,.,思考题3,组织培养的哺乳动物细胞S期长达5小时，经放射自显影测定DNA复制的速度是0.5微米/分，已知哺乳动物细胞DNA全长1.2米，计算染色体复制时共有多少复制叉在复制？8103（如何分析？）,.,思考题4,已知抹香鲸和猪的胰岛素具