一株丝状真菌的分类鉴定与特性研究

一株丝状真菌的分类鉴定与特性研究生物系 王凡指导老师 赵文婧 韩建荣摘要；运用载片观察法和菌落平板培养法对本实验室分离到的丝状真菌Mars进行了培养观察，并与标准菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana）3.4428进行比较，初步鉴定Mars可能属于白僵菌属 (Beauveria)。采用明胶琼脂平板法测定了Mars和3.4428的胞外蛋白酶，结果表明Mars的胞外蛋白酶酶活略小于3.4428。另外，实验测定了Mars和3.4428的产孢量，发现Mars的产孢量小于3.4428。并进行了室内感染松毛虫毒力的比较，结果显示3.4428的毒力强于Mars。关键词：丝状真菌；观察鉴定；胞外蛋白酶；产孢量本实验室分离到一株丝状真菌Mars，它在Mas培养基上能产生明显的溶钙圈，在牛奶培养基中培养能导致酸凝，并且使培养基由白色变为紫红色。该菌株在多种培养基上培养都没有发现有性孢子，初步鉴定是一种半知菌。本实验对该菌株进行了形态观察，并与购于中科院的标准菌株球孢白僵菌（Beauveria bassiana）3.4428相对比，以确定该菌株的准确分类地位。另外，根据球孢白僵菌所具有的一些生理生化特征，本实验对Mars的产孢量，胞外蛋白酶的活力及毒力等特性进行了初步研究。1 材料与方法1.1 供试菌株Mars菌株，保存在PDA斜面上，由山西大学微生物实验室提供。标准菌株球孢白僵菌（Beauveria bassiana）3.4428购于中国科学院北京微生物研究所，保存在查氏斜面上。1.2 试剂Hgcl2，吐温-100，磷酸缓冲溶液等。1.3仪器高压蒸气灭菌锅，超净工作台，恒温培养箱，电子显微镜，电子天平等。1.4 培养基共使用下列培养基12：马铃薯培养基（PDA），添加了蛋白胨的马铃薯培养基（PPDA），查氏培养基（CA培养基），明胶琼脂培养基：平板由1的明胶和1.5的琼脂配成。1.5实验方法1.5.1固体平板培养法从PDA斜面和CA斜面上分别挑取少量孢子接种到PDA、CA、PPDA平板上，25黑暗培养观察菌落形态。 1.5.2载片观察法1将圆形滤纸铺于培养皿的底部，其上放一U形玻棒及盖玻片和载玻片各一片，盖好培养皿盖，灭菌；用无菌玻棒直接蘸取已融化的固体培养基滴于培养皿中载玻片的中央；用接种环取少量孢子接种于载玻片上培养基小块的四周，加上盖玻片，并略向下轻压；为防止培养过程中培养基干燥，可于培养皿中的滤纸圆片上滴加无菌的20%甘油液3-4毫升，盖好皿盖；将盖好的培养皿置适宜的温度下培养，定期取出，观察显微结构。 1.5.3胞外蛋白酶的测定（使用明胶琼脂平板法3）平板由1的明胶和1.5的琼脂配成，各待试菌株配成1108孢子/mL的孢子悬液，用微量取样器取25L点滴在平板中央。每待试菌株6次重复，25黑暗培养三天，用15%的HgCl2（溶于2mol/L的盐酸）溶液处理,待菌落周围显现清晰的透明环后，倒去HgCl2，用直尺测量纵横两个方向的透明环直径和菌落直径，以透明环和菌落直径平均值之比作为胞外蛋白酶产酶量的指标。1.5.4产孢量的测定4分别将Mars和3.4428接种于PDA培养基、PPDA培养基、CA培养基上，25黑暗培养10d后，每个处理设置3个重复，在菌落核心至1/2处用直径为4.5mm打孔器打孔取样,置入盛有10mL 0.1吐温水的500mL三角瓶中，手摇震动10-15min。用两层纱布过滤后得孢子悬液，用无菌滴管滴一滴于血细胞计数板上，小心加放盖玻片，避免产生气泡，在显微镜下直接计数。从血细胞计数板上每个小方格（体积1/5，000，000mL）中的孢子数可进一步计算出3个重复单位面积产孢量的平均值。计算公式如下：样品孢子数/mm2=A525104稀释倍数15.91.5.4毒力测定4配制2108个/mL,2107个/mL的两种不同浓度的孢子悬液，挑取大小均匀、健康活泼的供试松毛虫虫体，取新鲜的松针孢子液中浸510s，取出停留23s，连同供试虫（100头）一并放入干净玻璃制养虫缸（直径10cm，高15cm）中，用白纱窗布罩住缸口，每个处理设三次重复，空白对照不喷任何物质，注意喷洒前先将菌液摇匀，后置入恒温培养箱中在25下黑暗培养，处理后3d更换新鲜松针，以后每2d更换1次松针，并在培养箱中放入湿棉花以保持湿度，至少保证湿度在75%左右，每2d定时检查幼虫的死亡情况，同时拣出死虫，PDA平板保湿培养以确诊死因。在除去虫粪，计算校正死亡率，并求死亡中时LT50。2 结果与分析2.1 载片观察法结果及分析将接有Mars与3.4428孢子的载玻片培养7d后，从培养箱中取出，将载玻片直接置于显微镜上观察。具体形态特征59描述如下： Mars：营养菌丝无色，粗1.23.0m，分生孢子梗多着生于营养菌丝上，产孢细胞常浓密簇生于菌丝或泡囊上，有时可多达十几个，极少数单生，产孢细胞基部多为球形，近球形，少柱形，个别产孢细胞基部特化为较长的细丝。颈部明显延长成粗1m，长达14m的产孢轴。轴上具小齿突，呈膝状弯曲（“之”字形弯曲），培养后期，在低倍镜下常见球型的密集孢子头（由泡囊，产孢细胞和分生孢子组成），分生孢子透明，光滑，多为亚卵型和椭圆型。（见图1、图2）。 Beauveria bassiana 3.4428：营养菌丝无色，粗1.23.0m,分生孢子梗多着生于营养菌丝上，产孢细胞常簇生于菌丝或泡囊上，最多可达7个，少数单生，产孢细胞基部多为球形，近球形，少柱形，产孢轴较长，可达17m。轴上具小齿突，呈膝状弯曲（“之”字形弯曲），培养后期，在低倍镜下常见球型的密集孢子头（由泡囊，产孢细胞和分生孢子组成），分生孢子透明，光滑，多为亚卵型和椭圆型，个别为长柱型。（见图3、图4）。图 1 Mars菌株的产孢结构（40） 图2 Mars菌株的产孢结构（10）图3球孢白僵3.4428 的产孢结构（40） 图4球孢白僵菌3.4428的产孢结构（10）通过实验观察，虽然Mars和3.4428在显微结构上有很大的相似性，但二者之间仍有细微差别。详见表1。表1 Mars与3.4428的异同菌株孢子头产孢细胞分生孢子Mars可见密集的孢子头大多数浓密簇生，多达十几个,极少数单生，产孢轴“之”字形 结构弯曲幅度较大，偶在短,的产孢轴顶端可发出不孕的细长的产孢丝.分生孢子透明光滑，多为球形、亚卵形，个别为长柱形.3.4428可见较密集的孢子头大多数簇生，最多达七个，少数单生，产孢轴“之”字形结构弯曲幅度较小.分生孢子透明，光滑，多为球形、亚卵形.2.2 固体平板培养观察10结果接种后的平板培养7d后，从培养箱中取出，观察菌落形态由表2可以看出在不同的培养基上Mars与3.4428的菌落形态比较相似，这两种菌在PPDA培养基上的菌落形态都有褶皱，呈辐射状分支，在PDA和CA培养基上菌落都无褶皱。所不同的是Mars的菌落形态呈绒毛状，在PPDA培养基上基质色泽为墨绿色；3.4428的菌落形态呈毛毡状。（详见表2）。表2 25培养7天的菌落形态菌株培养基菌落质地菌落色泽基质色泽Mars3.4428PPDAPDACAPPDAPDACA致密绒毛状，有褶皱，呈辐射状分支致密绒毛状，无褶皱稀疏绒毛状，无褶皱毛毡状，有褶皱，呈辐射状分支毛毡状，无褶皱毛毡状，无褶皱白色乳白色乳白色乳白色乳白色白色墨绿色淡黄色淡黄色黄色淡黄色橙黄色2.3不同培养基上的产孢量结果通过测定Mars与3.4428在3种不同培养基上的产孢量，可以看出Mars的产孢量低于3.4428。所用的三种培养基中Mars在PDA培养基上的产孢量最大，而3.4428在PPDA上的产孢量最大。（具体数值见表3）。表3 不同培养基上的产孢量及平均值菌株培养基产孢量 （106mm2）1 2 3平均值Mars3.4428PPDAPDACAPPDAPDACA1.48 1.54 1.763.11 2.39 2.993.68 2.36 2.018.05 7.89 8.086.70 4.66 3.623.93 4.21 4.841.592.832.688.014.994.332.4胞外蛋白酶的结果 利用明胶琼脂培养法测定了Mars和3.4428的胞外蛋白酶产量，结果表明Mars的胞外蛋白酶产量略低于3.4428。（具体数值见表4）。表4 Mars和3.4428的胞外蛋白酶产量比值及平均值。菌株胞外蛋白酶产量比值 1 2 3 4 5 6平均值 3.4428Mars2.06 2.13 1.94 2.03 1.95 2.99 1.83 2.00 2.02 2.08 2.13 1.772.101.972.5毒力测定结果表5不同种类和不同浓度百僵菌对油松毛虫的室内感染死亡情况菌株浓度（个/ml）试虫（头）不同时间幼虫的校正死亡率%2d 4d 6d 8d 10dMars3.442821072108210721081001001001002 28 40 47 655 31 47 63 793 35 51 68 826 41 54 77 96 表6不同种类和不同浓度百僵菌对油松毛虫的室内感染死亡情况菌株浓度（个/ml）回归方程(Y=a+bX)相关系数（R）死亡中时LT50显著性检验Mars3.44282107210821072108Y=0.826X-0.227Y=1.013X-0.275Y=1.090X-0.302Y=1.213X-0.3210.9850.9840.9940.9797.595.965.454.75*注：X=lgd(天数) Y=校正死亡率 结果表明，浓度是影响白僵菌分生孢子萌发、菌丝生长速度及白僵菌致病力的重要因素。松毛虫经两种菌、两种浓度悬液感染10d后，校正死亡率分别为65%、79%、82%、96%，经Duncon检验发现，2108个/mL的孢子液的使用效果和2107个/mL孢子的使用效果比较差异性显著。将校正死亡率转换为死亡几率，死亡时间转换成时间的对数，求出回归方程（见表6）。不同菌株和不同浓度的孢子液处理松毛虫的LT50值分别为7.59、5.96、5.45、4.75d，说明油松毛虫幼虫的死亡中时（死亡率达50%的天数）随浓度的降低而升高，分析其原因可能是孢子浓度低，对虫体的入侵能力下降。另外，Mars菌株和3.4428菌株的相同浓度对幼虫感染死亡率也不同。标准菌株3.4428的毒力（对松毛虫的致死力）强于Mars菌株。当然感染效果可能不仅受浓度因素和菌株因素影响还与环境因素和虫体间相互感染有关。 3讨论真菌分类主要基于形态特征（显微特征，菌落形态）和生理生化指标来研究，这种分类方法在分类史上仍占有很重要的地位11。载片培养法是观察各种菌株的显微特征的一种有效方法，这种方法既可以保持真菌自然生长状态，还便于观察不同发育期的培养物且培养物不易染菌。在本实验中，我们用了标准菌株球孢白僵菌3.4428与Mars菌株进行对比，根据菌落形态与显微特征，初步推断Mars是球孢白僵菌菌种下的一个菌株。 球孢白僵菌属于半知菌亚门（Deteromycotina）、丝孢纲（Hyphomycetes）、丝孢目（Hyphomycetales）、从梗孢科（Moniliaceac）、白僵菌属（Beauveria）是一种虫生真菌11，主要寄生在鳞翅目、半翅目、膜翅目等多种昆虫和多种壁虱上。在生物防治中受到人们的极大重视。迄今已发现，白僵菌会产生多种类型的代谢产物，包括毒素类，水解酶类有机酸类13。这些生理生化特征为菌种的分类鉴定提供了重要的依据。本实验由于实验条件的限制，只测定了Mars的胞外蛋白酶产量，产孢量及毒力等一些基本的生理生化特征，并与标准菌株球孢白僵菌做了对比，结果表明Mars也具有这些生理生化特征，结合菌落形态与显微特征的观察结果，初步鉴定Mars属于球孢白僵菌属。实验中发现将Mars和3.4428分别接种在牛奶培养基上摇床振荡培养数天后，Mars可使培养基发酵变酸，且培养基颜色由白色变成紫红色,，虽然标准菌3.4428也能使培养基变酸，但不能使培养基变色。但由于时间关系，目前这项实验仍在进行中。致谢：本论文是在山西大学生命科学与技术学院韩建荣教授的悉心指导下完成的。在完成论文的过程中，山西大学生命科学学院的康曼师姐、王丽同学以及山西大学生命科学学院微生物生理实验室的其他同学都给予了我大量的指导和帮助，在此我对他们表示衷心的感谢！参考文献：1沈萍,范秀容，李广武.微生物学实验.北京：高等教育出版社，1996.2赵斌，何绍江.微生物学实验.北京：科学出版社，2003，251265.3唐晓庆，李增智.球孢白僵菌胞外蛋白酶产生水平及其与毒力关系的研究1996，23（3）：279284. 4刘智辉，陈守文，郭志红，喻子牛.球孢白僵菌胞外蛋白酶和几丁质酶活性与对亚洲玉米螟毒力的相关性分析.生物多样性.2005，24（4）：365368.5李增智，白僵菌的分类和鉴定.中国虫生真菌研究与应用.1990，（2）：8995.6黄勃,李如春,王四宝,樊美珍,李增智.大别山区三中白僵菌的分离和鉴定.安徽农业大学学报.2000，27（2）：116118.7MacLeod D M. 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