钙成像实验操作及数据处理

.,刘丝丝2017年8月25日,钙成像实验操作及数据处理,.,钙成像实验操作,.,1.钙成像原理,基本原理：利用钙离子指示剂监测组织或细胞内钙离子浓度，进而反映组织或细胞内某些活动或反应,钙离子指示剂：能够指示钙离子的可视化物质,.,2.实验操作,操作步骤：（1）Fluo-4工作液配制：每管Fluo-4AM：+8lDMSO+2lF-127（2）Fluo-4工作液使用：储液稀释1000倍使用（倍稀释数可根据实验调节）：1mlDMEM+1lFluo-4工作液,主要试剂及仪器：Fluo-4指示剂，DMSO，F-127，DMEM，HBSS，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜,.,2.实验操作,（3）Fluo-4指示剂孵育：将培养皿中原培养基弃去，加入500-1000lFluo-4溶液，37孵育20min。（4）清洗：将Fluo-4溶液弃去，用不含有钙、镁离子的HBSS溶液清洗3遍，每次2-3min，最后加上相应的浴液开始拍摄。（5）钙离子成像：使用普通荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜进行拍摄。以LeicaSP5的CLSM为例：激发光：488nm采用xyt时间轴拍摄模式：Timeinterval：3s；Frames：200（根据实验而定）。,.,钙成像数据处理,.,必备软件,ImageJ,MATLAB,Origin,Photoshop,AdobeIllustrator,.,1.图片处理，采集数据,soft,stiff,stiff,stiff,soft,soft,1.1.新建件夹X，将待分析的组图件（200张）考件夹X中1.2.导图：打开ImageJ后，File-Import-Imagesequence（会弹出新框SequenceOptions,点OK）1.3.变换颜色：Image-LookupTables-16_colors（注意：如果是彩色的先转成灰度图）1.4.调对度：Image-Adjust-Brightness/Contrast（会弹出新框B&C,将图调节到最佳）-Apply（会弹出新框ApplyLUTtoall200imagenumbersslicesinthestack?ChooseYES）,.,1.图片处理，采集数据,soft,stiff,stiff,stiff,soft,soft,1.5.选细胞：Analyze-Tools-ROIManager（会弹出新框ROIManager）-把ShowallandLabels前打钩-主菜单栏选择选择不同形状具圈细胞（PS.先选择背景，再选择细胞）-每圈个细胞后点Add-圈完所有细胞后截屏保存图（PS.保存了标记细胞个数和顺序）新建件夹X中1.6.数据导出：ROIManager-More-MultiMeasure（会弹出新框MultiMeasure）-将MeasureAll200imagenumbersSlices打钩-OK-Results（会弹出新框Results）-File-Saveas（将Results数据保存为Excel格式命名Results.xls新建件夹X中）,.,1.图片处理，采集数据,soft,stiff,stiff,soft,soft,1.7.在件夹X中，新建个Excel件，将数据粘贴新的Excel中命名为Results1.xls，只保留编号、Mean、Slice三列，将Area列删除1.8.ClosetheprogramImageJ,在Analyze里面的SetMeasurements可以设置Mean值,.,2.Matlab数据处理,soft,stiff,stiff,soft,soft,2.0.starttheprogramMatlab2.1.复制程序：将程序件CalciumFlow20101105.m拷新建件夹X中，此时件夹X中应包括：原始图件夹、截屏图、Results.xls、Results1.xls、CalciumFlow20101105.m2.2.导件夹X：打开Matlab后，点右上按钮，会弹出新框浏览件夹，选中需导的件夹X后点确定，此时Matlab程序左侧会出现CurrentFolder，列出了件夹X中所有件2.3.双击打开件夹X中新建的Excel件Results1.xls（切勿打开原Excel件），程序上会弹出Results1.xls中的数据，点按钮Import-ImportData,.,2.Matlab数据处理,soft,stiff,stiff,soft,soft,2.4.修改程序：双击左侧打开件夹X中CalciumFlow20101105.m，弹出程序语，根据每次图具体情况修改程序，包括修改三条路径（foutin=fopen、fin=fopen、fout=fopen），所圈细胞个数（nreg=），总图数（np=），基线baseline（nnp=20，15,10,5）的图数，以及拍摄时间间隔（tstep=）2.5.运程序：点击运按钮-如若运成功，左侧件夹X中会出现in.txt和out.txt件，则表明运成功，否侧会出现运错误提醒2.6.ClosetheprogramMatlab,.,3.Origin数据作图,soft,stiff,stiff,soft,soft,3.0starttheprogramOrigins3.1.打开OriginPro8.5后，File-Import-SingleASCII-弹出新框导件夹X中out.txt件，弹出Book3.2.点击Book的左上全选