微生物限度检查法

.微生物限度检查法。1 .微生物限度检查法概要2 .我国药品微生物限度基准的发展状况3 .我国药品微生物限度检查方法的发展状况4 .微生物限度检查法所需的材料5 .微生物限度检查试验用物品的准备6 .无菌室技术要求7 .细菌、霉菌和酵母菌的检查方法.供试品的取样、保存及检查量试验操作前的供试液的制备对照用菌液的制备； 菌数测定阴性对照试验细菌、霉菌(酵母菌)检查程序供试液的稀释(10倍增量稀释法)注平皿中注入培养基的菌落计数菌数报告规则的注意事项8 .细菌、霉菌(酵母菌)的其他检查方法管稀释法(试管法、MPN法)过滤法计数板法仪器法平板涂布法； 表面涂布平板法过滤器培养法酵母菌镜检查计数法9 .大肠菌检查法的概要、原理检查程序增菌培养分离培养纯培养、革兰染色、镜检生化试验(IMViC )实验中的注意事项10 .沙门氏菌检查法11 .铜绿假单胞菌检查法12 .黄色葡萄球菌检查法13 .破伤风菌检查法14 .生螨检查法15微生物污染剂为保证药品质量，必须对微生物污染进行必要的控制和检测。 其意义在于药品污染微生物不仅威胁患者用药安全，而且直接影响药品有效性，因此药品卫生质量是药品质量的不可分割的一部分。 反映药品生产技术的科学性、合理性及质量控制水平。 通过检测，一切工艺条件、生产管理水平、生产者素质差，如果不注意文明生产单位和企业，其生产的药品、染色菌必然严重，不良率无疑较高。 微生物限度检查是提供药品卫生质量状况的重要依据，保证销售和使用中药品的有效性和安全性是促进和提高生产部门全面质量管理水平的重要依据。 微生物限度检查法概述，2 .微生物限度检查的范围根据用药要求，可分为规定灭菌的药品：注射剂和输液剂、体腔、严重烧伤、溃疡、出血和眼科药物等制剂。 非规定灭菌药品：包括常用口服制剂和一般外用制剂。 该部分制剂一般不要求绝对无菌，允许存在一定量的微生物，同时规定不能存在可疑的病原细菌。 由于病原菌范围广，各国药典将常见病原菌和指标菌规定为控制菌。 对于未规定的灭菌制剂，每克或每毫升的药品按剂型或品种规定：感染菌量检测：检测这些微生物的药品污染程度，包括细菌数、霉菌数及酵母菌数的测定。 控制菌检查：包括大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的检查等。3.药品微生物限度检测取样量和检测量药品微生物限度检测的困难，最根本的原因是检测对象本身的特殊性。 药品微生物限度检测对象的特性：不确定性：药品受外来微生物污染，这种污染在不可能的情况下可以多也可以少，其种类多样。 污染情况因生产、设备、原材料、管理、剂型等条件而异，药品本身并不固有。 微生物限度检查的对象还不确定。 药品规定的检查项目，除无菌检查、热原检查外，具有上述性质，其他项目无此特征。 这个经常被忽视。 污染对药品来说是意外的事件。 污染批号中的不合格品是随机变量。分布不均匀性：不均匀性是不确定性的另一种表现形式，在某批号内产品被污染、未被污染、分布不均匀的被污染部分中有很多、很少、种类复杂或单一。 由于污染源的复杂性，原料污染、工艺污染、空间污染、作业人员污染等构成污染量的多少有些差异，这种不均匀性是不均匀的。 此外，微生物具有群集性的群集大小、紧密度是遗传性的，群集的分散性差异极大，这一特征确实强化了不均匀性。 生物特征：以药典中活着的微生物为检查对象也是独特的特性。 因此，采样对微生物限度的检测值有很大影响。 药品未受污染时，样品不影响检测，批次产品存在污染物时，样品样品为随机变量，样品的影响如下：样品方法：不同样品方法对批次产品的代表性不同，测定值也不同。 抽取可疑样品和随机样品，其检出率和数字明显大于后者。 采样量：采样量的多少是样品的代表性的重要性，例如包含不合格率为10%的批次产品，在从其中提取2个样品来控制细菌检查的情况下，以81%的概率判定为合格品，在30件的情况下，以96%的概率判定为不合格品。 以上表明采样方法、采样次数、采样次数对测量结果有影响。 以控制菌检为例，决定感染菌的检测需要两个条件： (a )样品是否含有感染菌样品；(b )检测操作正确；(a )是前提条件。 中国药典2000年版规定提取方法和取样数量为：供试品为随机取样，一般取样量为检测量(2个以上的最小包装单位)的3倍量。 必须以异常供试品为对象进行抽样，对外观可疑的污染或有争议的复检样品提取污染或有争议的复检原样品。 必须以异常供试品为对象进行抽样，对外观可疑的污染或有争议的复检样品提取污染或有争议的复检原样品。 从药品、瓶子(外盖的内侧和瓶口的周围)的外观看到霉菌、生虫、变质的药品即使不继续检查，也必须直接判断为不合格。 在外表如上所述的情况下，无法将检查内容判定为合格。 因为感染了瓶口，所以对服用者来说不安全。 从瓶口直接吃药的话，感染的细菌会进入人体，瓶口一旦感染，瓶子内的药液就会被最终污染。 检验量和取样量是两种不同类别的量，后者是指从全批产品中提取的单位包装，前者是指检验量，一般的取样量比检验量多。 检验量只是样品量各包装的混合样品的一部分。 中国药典2000年版规定，检测量每次至少取2个样品10克或10毫升，中药蜜丸至少取4克以上10克。 目前，中国以1克或1毫升、膜剂以10cm2为报告单位的英美药典和欧洲药典均以1克或1毫升为限量，但抑制细菌则以10克或10毫升为限量，严于我国的限量规定。 也就是说，采样量和检测量的大小对检测结果的影响很大(虽然现在的采样计划不科学，但检测遗漏率很高)。 药品微生物检测是一种破坏性检测，检测一根(箱)破坏一根(箱)，检测量越大破坏性越大，特别是对贵重药品，生产部门、经营部门的损失也越大。 因此，在满足样品检验的基本要求的同时，如何决定生产、经营者接受的样品方案，是目前亟待解决的问题。 但现行规定必须遵守，不得随意变更，尤其不得减少(对贵重微量包装的药品适当减少检测量的情况除外)。微生物限度检查方法的发展状况，1.1980年我国的药品微生物限度检查业务正式发行了药品卫生检验方法。 2.1984年出版第二版药品卫生检验方法。3.1990.12年中检所出版的第三版，主要是结合原方法中各地改写意见较多问题的部分检测方法和增加供试液制造方法的国内外检测方法，在某些内容上作了相应的变更，并参考国家标准的制定方式进行编制。 4.1990年版药典第二补本收录微生物限度检查法。 这也是我国第一次在药典上收载这种方法。 5.1995年版药典也收录了该检查法，少数剂型都收录了限度规定。 (20个化学药品的规定限度)。 6，2000年版药房方一，两部分同时收容了检验法和限度标准。 首次同时发布微生物限度检查法和限度标准。 微生物限度标准的发展情况是，1.1972年开展这项工作的2.1978年中国首个药品卫生标准颁布的3.1986年修订的药品卫生标准颁布， 1987年12月1日起供内部执行的4.1989年颁布了药品卫生基准补充规定和说明的5.1990年版药典第二补充书中收录了20种化学药品种类的微生物限度基准规定，与国际惯例一致的6.1995年版药方少数剂型(滴眼剂等)收录了微生物限度。 微生物限度检测法表明，无菌生长的7.2000年版药典按剂型、中西药分类规定微生物限度，一些生化药品在各论文中具体规定的营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基酵母浸出粉蛋白胨琼脂培养基(YPD )、胆盐乳糖培养基(BL ) 4-甲基丝氨酸蛋白酶培养基(MUG )乳糖培养基5%乳糖培养基蛋白酶水培养基柠檬酸盐培养基曙红亚甲基蓝琼脂(EMB )麦克康琼脂(MacC )营养肉汤微生物限度检测常用的检测设备和器材， 恒温培养箱3035361霉菌培养箱2528恒温水浴箱451净化台生物显微镜1500X体视显微镜或放大镜冰箱电气干燥箱250300高压蒸汽消毒器电子天平或药物天平检测量0.1g均化器或乳钵锥瓶100ml、250ml、500ml 直管1ml、计量杯10ml试管18x180mm、13x200mm、30 x200mm试管培养皿9cm培养皿陶瓷盖12cm量筒100ml、500ml、1000ml过滤器和微孔过滤器孔径0.450.02um注射器1ml、5ml 30ml载玻片和盖玻片接种针和接种环试验架乙醇灯康氏振荡器离心分离机5004000/min紫外灯365nm玻璃和搪瓷消毒缸(带盖)大、小橡胶乳头乙醇棉球和碘伏棉球灭菌剪刀、镊子、 叫做钢锥灭菌的样品纸灭菌不锈钢药匙配比，记号笔(玻璃铅笔)白磁盘，洗脸盆实验记录纸，细菌，霉菌和酵母菌的检查方法(平盘菌落计数法)，(1)试验品的取样，保存和检查量1 .试验品随机取样。 一般的取样量(2个以上的最小包装单位)是检查量的3倍量。 2 .以异常供试品为对象的抽样。 抽样时，如果发现异常或可疑样品，请选择有疑问的样品。 但机械损伤，明显破裂的包装不得样品。 药品、瓶口(外盖的内侧及瓶口的周围)、从外观看到长螨、霉菌、虫蚀及变质的药品，可直接判断为不合格，无需取样检查。 在外观如上的情况下，不能检查内容物判断为合格。 3 .供试品经检验后，应立即检验。 有困难时，保存在该品种规定的贮藏条件(一般为冷暗处干燥处)，不要冷藏或冷冻，防止供试品内污染菌因贮藏条件不当而致死、损伤或繁殖。4.供试品在检查前，请保持原来的包装状态，不要打开。 包装好的样品不能作为样品。 5 .供试样的取样应在净化条件下无菌操作，严防再污染。 (原料药、装量大的药)6.剂型检测量应当从两个以上的包装单位(中药蜜丸、膜剂、两个以上的包装外，还有四个丸、一个以上的样品)中选取。7 .固体及半固体(粘稠性供试品)制剂检查量为10克。 8 .液体制剂的检验量为10毫升。 9、除膜剂另有规定外，中药膜剂检测量为3050cm2，化学膜剂及生化膜剂检测量为100cm2。 10 .贵重或微量包装供试品的检验量可酌情减少。 除有特别规定的情况外，口服固体制剂为3克以上，液体制剂使用原液者为6毫升以下，供试液者为3毫升以下，外用药品为5克以下，实验操作前的准备为1 .供试品和灭菌的平盘、玉米瓶、均化器杯、试管、乳钵、吸管(1ml ) 每次实验所用的物品要事先计划好，准备好足够的量，操作中不要进出操作间。 编号后，拆下所有外包装(牛皮纸、布)。 另外，增菌液、培养基(营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、保持在45左右的水浴中)、MUG培养基试管等湿热灭菌的物品称量纸、手术镊子、剪刀等干热灭菌的物品2 .打开无菌室紫外杀菌灯和空气净化装置，运转30分钟以上。 3 .作业人员用肥皂洗手，关掉紫外线杀菌灯，进入缓冲室，更换工作鞋。 再用0.1%的苄烷铵溶液或其他消毒液清洗手，用酒精棉擦拭手，戴无菌衣服、帽子、口罩。4.操作前用酒精棉球擦手，用碘伏棉球(也可以是酒精棉球)擦拭试验品瓶、箱子、袋子等开口部的周围，用干燥后灭菌的手术镊子或剪子打开试验品。 (3)供试液的制备(1:10供试液)根据供试品的理化特性和生物学特性用适当的方法制备供试液。 不要改变污染微生物的数量和种类。 1 .液体供试品取供试品10ml，加入稀释剂90ml，混合，作为供试品。 (有些书取10ml，放入灭菌玉米瓶，加入稀释剂90ml，摇晃。 油剂可以加入适量的山梨酯-80，气溶胶、喷雾剂的供给品，将供给品放入冰室内2hr后取出，用灭菌锥小心打孔，使喷雾剂慢慢放出，用灭菌注射器加入稀释剂，混合后，吸入10g或10ml的供给品USPXXIV规定，导出放射剂后，吸收10ml，或者取10g作为供试品，加入稀释液使其达到100ml。 合剂(指蜂蜜或含王浆者)和滴眼剂可作为供试品供试液。 (滴眼剂不得检测霉菌或酵母菌)。 含蜂蜜、王浆的制剂2 .固体、半固体或粘稠的供试品称为供试品10g，装入加有0.9%无菌氯化钠100ml的匀浆杯，用匀浆(30005000r/2-4min )或其他适当的方法(振荡器或乳钵研磨等方法)分散混合，供试液在制造过程中，根据需要加入适量的聚山梨-80，可以适当加温，但不要超过45。3.非水溶性的供试品软膏剂、乳化剂称为供试品5g(5ml )，灭菌熔融后放入含有保温在45左右的苏格兰威士忌-8050g、单硬脂酸甘油酯3g、山梨酯-8010g的混合物的烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌后，用45左右的0.9%无菌氯化钠。 取供试品10ml，加入无菌聚山梨-8058ml，均匀挥发，加入稀释剂100ml。 取供试品10g，放入灭菌玉米瓶中，加入适量的稀释剂，在45左右的水浴中保温10min，溶解，加入无菌的山梨-8058ml，摇动乳化，再加入稀释剂(稀释剂和山梨-80的总量为100ml )，摇动混合。 茶剂取10g供试品，放入灭菌玉米瓶中，加入100ml稀释剂，摇晃30秒，用灭菌纱布过滤(如果是袋装茶，直接取2袋，样品结果为1:10加入稀释剂，浸泡)。糊丸剂(如肝油丸等)和胶囊剂糊剂(如阿胶)取少许糊剂，捣碎，取10g，用乳钵仔细研究，转移到250ml玉米瓶中，加入稀释剂100ml，放入45的1水浴中，振荡溶解，1:10供试验液糊丸