DNA多态性及其分析技术.ppt

第一部分概述了多态性。首先，不同物种的生物和同一物种的不同个体之间有许多差异。它被称为生物多态性，即生物多态性。生物群体中个体间的差异是由营养和气候等环境因素引起的。有些是由遗传因素引起的。由遗传因素引起的变异形成一系列多态性，称为遗传多态性。(2)当具有遗传分离的标准基因座具有两个以上等位基因时，最常见等位基因的频率不超过0.95或0.99，该基因座被认为是多态性的。在某些情况下，一个基因位点只被一个基因占据，但有时这个基因在这个位置不存在，然后会出现“是”和“否”的情况，这被称为二型性。3.分类遗传多态性可分为两类：遗传表型多态性和DNA多态性。遗传控制显示的性状是遗传表型。遗传表型多态性的检测有其局限性：遗传表型多态性仅反映编码基因的部分变异。后者仅占人类基因组总DNA的10%(不到10%)。基因和基因相关序列占总DNA的25%。DNA序列中的同义突变不会引起表型变化。此时，不能通过检测表型来发现编码基因的变异。(3)基因表达可能不同。在不同的生长条件下，具有相同基因型的生物可能具有不同的表型。通过检测表型多态性来推断基因有时是错误的。只有通过分析DNA的多态性，我们才能真正深刻地揭示生物的多态性。人类基因组序列概况，30亿个人类基因组碱基对，70% 80%的非基因序列，20% 30%的基因及相关序列，编码序列10%，20% 30%的中等或高重复序列，70% 80%的单拷贝或低拷贝序列，60%的簇重复序列，第二节DNA多态性分类，DNA是遗传信息的物质基础，因此它是反映个体差异的最基本的东西。DNA序列组成的个体特异性主要表现在以下类型的DNA多态性。1.遗传多态性是由控制性状的基因的碱基组成的差异引起的。等位基因特异性探针(ASO或SSO探针)或限制性消化用于分析。例如，人类白细胞抗原(HLA)系统在编码HLA-DR抗原的位点上有200多个等位基因。重复序列多态性连续重复序列多态性(VNTR): 相同的核心序列，不同的个体重复不同的时间。(2)不同的重复序列有不同的核心序列。(3)在核心序列之间，不同个体之间在插入片段的存在与否或插入片段的长度上存在差异。因此，两个不相关个体之间的VNTR变异可以达到完全个体特异性的程度，这是DNA指纹形成的基础。中度重复分散重复序列多态性。在哺乳动物基因组中。性染色体多态性X染色体重复序列多态性Y染色体特异性片段多态性。4.线粒体DNA多态性在两个不相关的个体之间，人类线粒体DNA的D环只有0.27%的可能性是相同的。第三节DNA多态性分析技术1。RFLP分析技术的基本原理限制性片段长度多态性技术(RFLP):用特定的限制性酶消化不同的DNA片段，由于不同的DNA碱基组成，会产生不同长度的限制性片段。以这种方式，通过用合适的限制性酶消化待分析的DNA片段，可以根据切割的片段是否具有相同的长度来推断DNA序列是否相同，然后将片段与标记的相应的DNA探针杂交，从而显示的图谱可以反映基因组DNA碱基序列的组成是否存在差异。该技术的基础是通过核酸的限制性片段长度多态性来揭示碱基序列组成的差异。、提取DNA(来自血液或组织)、培养细菌、人工合成探针、限制性酶消化、琼脂糖凝胶、南方转移、固定化、质粒纯化、探针纯化、标记探针(同位素或非同位素)、预杂交、杂交、膜洗涤、反射放射自显影或后颜色分析结果、RFLP技术图、RFLP技术的基本步骤如下：1。目标DNA的制备。首先提取人类基因组DNA，基因组DNA被适当的限制性酶酶解。具有不同长度的酶水解的DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离，以便它们根据片段的长度排列。DNA片段被变性，然后转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜(称为南风膜)上，并固定在这些载体上。二。核酸探针的标记纯化用作探针的DNA片段，用同位素(例如32P)或非同位素标记，以及纯化后的使用。(3)杂交显示标记的探针与硝酸纤维素膜或尼龙膜上的单链DNA杂交，膜清洗后或加入酶的反应底物显色后进行放射自显影，然后分析显示的条带。影响RFLP 1的几个因素。影响限制性内切酶RFLP作图的重要因素。市场上有100多种常见的。星号*活性是非特异性酶活性。反应溶液中甘油和乙醇的浓度以及酶解的DNA的质量和浓度。2.核酸探针不同的DNA探针将显示不同类型的RFLP图谱。1.基因探针人类基因组中的一个基因片段。它经常被用来研究人类的遗传疾病。2.随机探针从人类基因组DNA中随机选择一个DNA片段，其功能未知。采用统一的命名法。D是它起源的染色体的编号，S是单个拷贝(NF代表多个片段)，最后指定给定的序列号。如D14S1等。可以进行疾病基因连锁分析。3.重复序列探针基因组中的重复序列可以同时揭示整个基因组中许多位点的DNA序列的多态性。例如，由Jeffreys等人在1985年发现的高度重复的小卫星DNA探针可以揭示人类DNA序列的多态性，并且这种多态性在不相关的个体中相同的可能性极小(只有310-11)，这被称为DNA指纹。它可以用于个人识别、亲子鉴定和人类学研究。4.人工寡核苷酸探针可以检测人类基因组中分散的重复序列，也可以用于个体特异性研究。5.动物基因组的一个脱氧核糖核酸片段被用来研究动物，如昆虫。它可以作为相关研究和物种及类群分类的探针。注1。首先，测试对象的DNA分子必须保持大分子。在提取脱氧核糖核酸的过程中，避免了将脱氧核糖核酸分子人工机械切割成脱氧核糖核酸的小片段，否则最终的结果可能是一种幻觉。2.用限制性内切酶消化大分子DNA时，必须完全消化，否则会产生假结果。3.消化后的脱氧核糖核酸浓度不应太高。4.电泳需要低压电泳。5.杂交前探针必须完全变性。6.根据探针的标记、探针与靶DNA的序列互补程度以及气相色谱含量，掌握洗膜条件。7.放射自显影期间，应根据探针标记的放射特异性活性和靶DNA的量来确定暴露时间。Jeffreys等人从人类染色体DNA中分离出一个重复序列作为探针，并对人类染色体DNA进行了RFLP分析(称为DNA指纹分析)。用限制性内切酶完全消化总的DNA后，用放射性探针进行Southern印迹。每个人的DNA产生的阳性杂交带是特异性的，儿童的阳性杂交带有一半与父亲的相同，另一半与母亲的相同。使用这种重复序列作为探针，不同人的DNA指纹分析产生相同模式的机会不到60亿分之一。可用于法医鉴定、血缘鉴定等。这种实验方法提供的证据在1988年被英国法院批准。人体DNA指纹分析示意图儿童的DNA指纹分别对应于其父亲和母亲、父亲和儿子以及母亲的DNA指纹中相应的分子杂交带。2.聚合酶链反应分析基因多态性的基本原理应用聚合酶链反应分析基因多态性1。基因多态性分析反向斑点杂交技术：等位基因特异性探针(ASO探针)和多聚(dT)尾点样固定在硝酸纤维素膜上。扩增产物与它们杂交并在显色反应后进行解释。2.分析扩增的RFLP(调幅-RFLP)脱氧核糖核酸扩增(长)限制酶消化琼脂糖电泳分析3。聚合酶链反应扩增产物分析琼脂糖电泳分离分析扩增片段长度多态性DNA，4。扩增片段序列的多态性分析。不对称聚合酶链反应序列分析比较，5。RAPD是随机扩增多态性DNA的缩写。该方法最初由Williams等人发明。该方法使用随机序列的9-10个核苷酸的引物对基因组DNA进行PCR扩增，然后进行电泳分离。用任何序列的引物扩增基因组DNA都可以分析其多态性，而不需要知道特定的DNA序列。它不仅可以用于个人识别，还可以用于其他各种基因研究。有些人认为随机引物扩增的DNA序列被称为RAPD标记，用来比较两种不同生物的基因差异。由于整个RAPD都是显性的，所以不可能区分扩增的DNA片段是来自杂合体还是纯合体。目前，有明显迹象表明RAPD标记具有广阔的应用范围和前景。它不仅可以用于基因定位、动植物培育、DNA指纹分析，而且在染色体特异性DNA片段的分离和鉴定、杂交细胞系或遗传资源中染色体大片段的缺失或重复筛选中也将发挥重要作用。其优点表现在以下几个方面：一系列通用引物可用于分析不同种类的生物。可用于制备探针和分析未知的DNA序列。(3)由于每个RAPD标记对应一个DNA序列，因此可以大大简化各种相关研究。(4)RAPD技术比RFLP技术和普通聚合酶链反应技术更有可能使基因型鉴定自动化和高效基因定位更加有效和简单。此外，人工合成的随机引物可以在实验空间进行交换，比克伦德DNA片段作为探针更容易、更快速，也避免了DNA分子杂交的麻烦。第四节DNA多态性分析技术的应用1。人类遗传病的研究有些人类遗传病是由基因碱基序列的突变引起的，这种突变导致某一限制性酶识别位点的缺失。因此，不能用这种限制性酶切掉与正常人相同大小的限制性片段。其他疾病显示出相反的情况，限制性酶识别位点以前是不可用的。有时这种疾病是由插入某个片段引起的。基因多态性的聚合酶链反应分析也可用于产前诊断。对于严重影响患者在婴儿期或青春期工作和生活能力的遗传性疾病的产前诊断以及产前终止妊娠尤为重要。2.建立人类基因组的遗传连锁图谱，对一些有遗传倾向的疾病进行相关分析；3.用作诊断单卵双胞胎或异卵双胞胎、亲子鉴定、法医个人鉴定和人类学研究等的遗传标记。4.直接基因分型