荧光免疫技术总论PPT课件

第8章荧光免疫技术，第1节概述1、荧光的基本知识2、荧光物质。2、第2节荧光抗体技术1、标本制备2、荧光抗体制备3、荧光抗体染色及结果判断4、荧光显微镜基本结构第3节荧光免疫分析的类型1、时间分辨荧光免疫分析2、荧光偏振免疫分析3、荧光酶免疫分析3、第四节荧光免疫分析在医学检验中的应用1。荧光抗体技术的应用2。荧光免疫分析应用概述1。第一部分概述：荧光。荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态。当它回到基态时，它以发射光的形式释放能量，这被称为荧光。荧光、发射光谱和激发光谱的基础知识。发射光谱是指在固定激发波长下不同波长下记录的样品发出的荧光强度。激发光谱是指由不同波长的激发光激发的样品记录的相应荧光发射强度，具有固定的检测发射波长。荧光的基本知识，荧光效率，定义：荧光物质分子将光能转化为荧光的百分比计算公式：荧光效率=，荧光的基本知识，荧光寿命，定义：荧光物质被激发后荧光衰减到一定程度的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。荧光的基本知识，荧光猝灭，定义：荧光物质在一些物理和化学因素的作用下，发射荧光减弱甚至褪色，称为荧光猝灭。如紫外线、高(20)、苯胺、苯酚、硝基苯、碘等。荧光的基础知识，10，荧光偏振，FH-FLP=- FH荧光，荧光基础知识，11、荧光物质是一种能吸收激发光的光能并发出荧光的物质。普通荧光物质、二类荧光物质、二类荧光抗体技术、荧光抗体技术的基本原理、荧光素标记的抗体与切片中的组织细胞抗原反应，经洗涤分离后，用荧光显微镜观察显示特定荧光的抗原-抗体复合物及其位置，定性和局部检测组织细胞抗原，或定性和滴定自身抗体。一、荧光抗体技术的内容，荧光抗体制备标本制备荧光抗体染色荧光显微镜检查，抗体要求高特异性和高亲和力，通过纯化和提取免疫球蛋白，首先，荧光抗体的制备，可以与蛋白质化学基团形成共价键，与蛋白质结合不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于除去。荧光效率高，与蛋白质结合后仍保持较高的荧光效率。荧光颜色与背景组织的颜色形成鲜明对比。与蛋白质结合后，蛋白质原有的生化和免疫特性不受影响。该标记方法简单、安全、无毒。与蛋白质的结合稳定，易于储存。荧光素要求，荧光抗体的制备，抗体的荧光素标记，标记原理：利用抗体蛋白的游离氨基和FITC的异硫氰酸基在碱性溶液中形成硫代甲酰胺键，将抗体和FITC结合成荧光抗体。标记方法：搅拌法：适用于标记体积大、蛋白质含量高的抗体。标记时间短，荧光素量少，但有非特异性染色。透析法：适用于标记样品量少、蛋白质含量低的抗体。标记相对均匀，非特异性染色相对较低。荧光抗体的制备，游离荧光素及其降解产物的去除：透析或凝胶过滤以去除荧光素的未结合和过度结合的抗体：阴离子交换色谱法以去除交叉反应性或不需要的抗体：动物肝脏粉末或固相抗原的吸收，荧光抗体的纯化，荧光抗体的制备，荧光素与蛋白质的结合率：F/P=抗体滴度：双向免疫扩散试验抗体特异性：吸收试验，抑制试验抗体特异性染色滴度：双重稀释，荧光抗体的鉴定，荧光抗体的制备，-20:保存1-2年真空干燥：长期保存，保存组织切片：冰冻切片、石蜡切片(最常用)印张：器官或组织涂片，如肝脏、脾脏、淋巴结等。各种体液、穿刺液、细菌培养和细胞悬浮培养细胞：单层培养细胞、样品类型、2、样品制备。冰冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构不清。石蜡切片：组织细胞结构清晰，抗原丢失率高。组织切片的类型，标本的制备。23、固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等。保存：4，-20，标本的固定和保存，标本的制备，直接法，直接荧光抗体染色法示意图，荧光素标记的特异性抗体直接与相应的抗原反应。第三，荧光抗体染色和结果判断，间接法，特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体与第一抗体结合。间接荧光抗体染色示意图、荧光抗体染色和结果判断、双重标记法，两种荧光素标记的两种不同特异性抗体分别与同一标本反应，用荧光显微镜观察两种颜色的荧光。荧光抗体染色和结果判断。27、建立实验对照：阳性对照和阴性对照，以区分：细胞质型的显色分布、核型和膜表面型的特异和非特异染色阳性细胞、荧光抗体染色结果判断、荧光抗体染色和结果判断。28，“-”:没有或仅发现极弱的荧光。荧光微弱，但清晰可见。荧光很亮。明亮的强荧光。“”以上的比荧光强度为正，对照光应为“-”或“”。根据呈现“”的血清的最高稀释度确定特异性抗体滴度。荧光抗体染色结果判断、荧光抗体染色和结果判断、荧光显微镜、一定波长的激发光激发样品产生一定波长的荧光，对样品结构或其成分进行定性、定位和定量观察和检测。(4)荧光显微镜的基本结构：光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯滤光片：隔热、激发和吸收滤光片光路：透射光、落光聚光镜：明场、暗场和相差荧光聚光镜：消色差透镜、荧光显微镜、荧光显微镜的基本结构、隔热滤光片：阻挡红外线通过和隔热。激发滤光器：位于光源和物镜之间，它可以选择性地透射紫外线可见波长的光域，提供适当的激发光。吸收滤光器：位于物镜和目镜之间，阻挡激发光，发射荧光保护眼睛。荧光显微镜、滤光器、荧光显微镜的基本结构、透射光：照明光通过聚光器从样品下方穿过样品并进入物镜。落光：照明光从样本通过垂直照明器照射到样本，并被样本反射到物镜。透射荧光显微镜的光路(A)，下落荧光显微镜的光路(B)，荧光显微镜的光路，荧光显微镜的基本结构，第三节荧光免疫分析的类型，荧光免疫分析的基本原理，结合抗原抗体反应和荧光物质的发光分析，检测抗原抗体中的特定荧光强度，荧光免疫分析技术的类型，荧光免疫分析方法的类型，非均相荧光免疫分析：时间分辨荧光免疫分析，荧光酶免疫分析均相荧光免疫分析：荧光偏振免疫分析，短自发荧光寿命：1ns10ns 10 ns，长寿命33610 s 1000 s，短寿命荧光，然后测定镧系元素完全衰变后的特异性荧光，基本原理，时间分辨检测原理示意图，时间分辨，第一，时间分辨荧光免疫分析， 斯托克斯位移：镧系斯托克斯位移的激发光谱和发射光谱之间的波长差大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠，斯托克斯位移，基本原理，时间分辨荧光免疫分析，发射光谱带窄：613nm，干扰小的激发光谱带宽：300nm-350nm，灵敏度高，基本原理，发射光谱和激发光谱，时间分辨荧光免疫分析， 比活度：单位时间内检测的信号量荧光激发光源激发每个标记分子1000次/秒，比活度提高，基本原理，荧光标记的相对比活度，时间分辨荧光免疫分析，-二酮结合，Eu3解离，酸性增强溶液，荧光增强，Eu3标记抗原抗体复合物，基本原理，信号增强，时间分辨荧光免疫分析，镧系铕(Eu3)(最常用)钐(Sm3)铽(Tb3)钕(Nd3)镝(Dy3)，标记物，普通荧光物质的荧光寿命标记方法：一步法：先螯合Eu3，再连接蛋白质二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3，时间分辨荧光免疫分析，方法类型，双抗体夹心法固相抗体竞争法固相抗原竞争法，时间分辨荧光免疫分析，方法类型，时间分辨荧光免疫分析(双抗体夹心法)示意图，双抗体夹心法固相抗体和Eu3标记抗体与待测抗原结合形成固相抗体-待测抗原-Eu3标记抗体复合物，Eu3在酸性增强溶液中解离，和时间分辨荧光免疫分析、方法类型、待检测抗原的固相抗体竞争和Eu3标记抗原与固相抗体的结合竞争。孵育和洗涤后，将荧光增强液加入固相以测量荧光强度，荧光强度与待检测抗原的含量成反比。时间分辨荧光免疫分析法、方法类型、固相抗原竞争法、待测抗原和固相抗原竞争结合定量Eu3标记抗体。孵育和洗涤后，将荧光增强液加入固相以测量荧光强度，荧光强度与待检测抗原的含量成反比。时间分辨荧光免疫分析，高灵敏度：最低可检测量10-18摩尔/升，分析范围宽：4-5个数量级标记稳定：长有效寿命，快速测量，易自动化，易污染，背景增强，方法评估，时间分辨荧光免疫分析，一个方向的平面光通过偏振滤光片后称为偏振光。偏振荧光(绿光，525 nm 550 nm)，偏振光(蓝光，485nm)，荧光物质，基本原理，2，荧光偏振免疫分析，抗原抗体竞争反应AgF分子小，旋转速度快，偏振荧光弱AgF-Ab分子大，旋转速度慢，偏振荧光强如果待检测的抗原较多，AgF-Ab较少，AgF较多，偏振荧光弱待检测抗原含量与偏振荧光强度成反比， 荧光偏振免疫分析原理示意图，基本原理，荧光偏振免疫分析，方法评价，稳定荧光素标记试剂，样品用量少，使用寿命长，重复性和快速性好，易自动化，检测灵敏度较低，适用于中小分子物质，比非均相荧光免疫分析方法，荧光偏振免疫分析，基本原理，示意图d三、荧光素酶免疫分析、酶和荧光底物、荧光素酶免疫分析标记用酶和荧光底物、荧光素酶免疫分析、方法类型、双抗体夹心法、双抗原夹心法、固相抗原竞争法、荧光素酶免疫分析、方法类型、双抗体夹心法、固相抗体和酶标记抗体与分析物反应形成固相抗体-抗原-酶标记抗体复合物，加入底物进行酶促发光反应，发光量与待测抗原含量成正比。荧光素酶免疫测定(双抗体夹心法)、荧光素酶免疫测定、方法类型、双抗原夹心法的示意图固相抗原和酶标抗原与待测抗体反应形成固相抗原-待测抗体-酶标抗原复合物，加入底物进行酶促发光，发光量与待测抗体的含量成正比。荧光酶免疫分析法，方法类型，固相抗原竞争法待测抗原与固相抗原竞争结合定量酶标抗体，洗涤除去未结合部分，留下固相抗原与酶标抗体形成的复合物，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待测抗原含量成反比。荧光素酶免疫测定法，方法评价，利用酶与荧光底物的化学反应作为扩增体系，提高背景荧光干扰测量的灵敏度，利用固相荧光素酶免疫测定法具有良好的效果，荧光素酶免疫测定法，第4节荧光免疫测定技术在医学检查中的应用，自身抗体检测，抗核抗体(同质型)，抗核抗体(核膜型)，抗核抗体(斑点型)，1，荧光抗体技术的应用，病原体检测，寄生虫(猴胚胎肾细胞中的弓形虫)，细菌(藤黄微球菌)，荧光抗体技术的应用，免疫病理学检测，肿瘤(人肝癌63、细胞表面抗原和受体的检测，游离细胞经荧光抗体特异性染色后，通过专门设计的仪器中的喷嘴一个接一个流出，单色激光照射发出的荧光信号被荧光检测器检测，各种数据自动处理。(5)特殊应用：流式细胞仪分析和荧光免疫分析可用于检测淋巴细胞表面的镉抗原、抗原受体、补体受体、氟氯烃受体，并对淋巴细胞及其亚群进行鉴定和计数。荧光抗体技术的应用，时间分辨荧光免疫分析：蛋白质、激素、药物、肿瘤标志物、病原体抗原/抗体等的荧光偏振免疫分析。药物、维生素、激素、常规生化项目等的荧光酶免疫分析。病毒抗体、细菌和毒素抗原、激素、肿瘤标记物等。2、荧光免疫分析的应用。65，1。荧光、荧光效率、荧光寿命和荧光猝灭的概念是什么？2.常用的荧光物质是什么？3.荧光免疫技术有哪些类型？4.荧光抗体技术的基本原理是什么？3.什么是荧光抗体？如何制备、纯化和鉴定荧光抗体？4.荧光抗体染色的方法有哪些？各自的反应原理是什么？5.荧光免疫分析的基本原理是什么？方法有哪些