生物制药(第五章)PPT课件

.,1,第五章多肽与蛋白质类药物,.,2,本章主要内容多肽及蛋白类药物的一般生产方法重要的多肽类药物生产工艺重要的蛋白质类药物生产工艺本章要求（1）掌握蛋白质提纯的一般方法（2）掌握肽的固相合成法（3）熟悉胸腺素、干扰素、胰岛素、白蛋白的制备工艺（4）了解胃膜素等的生产方法,.,3,第一节多肽及蛋白质类药物的生产方法,一、蛋白质类药物的分离与纯化（一）材料选择原料来源:动、植物组织和微生物选择原则:富含所需蛋白质多肽成分易得易提取无害,基因工程菌（或细胞）、转基因动、植物,影响天然蛋白质类药物质量、产量和生产成本的因素：,（2）发育生长阶段,（1）种属,胸腺原料必须采自幼龄动物,一般从胎儿、胎猪或胎牛肝中获得,（3）生物状态（4）原料来源,（5）原料解剖学部位（6）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求,胃粘膜总提取物、胃蛋白酶、凝乳酶、粘多糖,.,7,（二）蛋白质提纯的一般方法分离依据：分子量大小溶解度电荷吸附性质对其他分子的生物亲和力,.,8,等电点的概念在一定pH环境中，某一种蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，或解离成两性离子，其净电荷为零，此时环境的pH值即为该蛋白质的等电点,酸性,碱性,1、根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质,.,9,等电点时蛋白质的特性性质比较稳定，物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等均最小等电点的偏移两性物质的等电点会因条件不同（不同离子强度、有机溶剂）而改变。,当盐存在时，pr若结合较多阳离子子，则PI向较高的pH偏移；反之，PI移向较低pH,.,10,根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质的方法：等电点沉淀法用等电点法沉淀蛋白质常需配合盐析操作，而除去不需要的杂蛋白时，常需配合热变性操作。等电聚焦电泳a.分离蛋白质b.测定蛋白质的等电点,.,12,2、根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质蛋白质是生物大分子,不同种类蛋白质分子量大小不同.方法：凝胶过滤法、超滤法、离心法及透析法适用范围：蛋白质与其他小分子物质分离，以及大小不同的蛋白质分离。注意用超滤法时，超滤膜截留分子量常与实际情况不一致。分子量相近的蛋白质由于在介质中有呈线形溶质或者是球形溶质的区别，可能出现不同的结果。（分子形状）,凝胶过滤（体积排阻色谱）,.,15,3、根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质蛋白质溶解度的影响因素溶液的pH离子强度溶剂的电解质性质温度,.,16,根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质的方法：a,盐溶与盐析法硫酸铵分级沉淀b,结晶法c,低温有机溶剂沉淀法常用溶剂：乙醇和丙酮,.,17,4、根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质原理：利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电作用力的差别进行溶质分离。蛋白质的离子交换剂：阴离子交换基：DEAE（二乙胺乙基）、QAE（季胺乙基）阳离子交换基：CM（羧甲基）、SP（磺丙基）、P（膦酸基）骨架材料：葡聚糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺,纤维素商品化离子交换剂：DEAE-SephadexA-25,.,18,离子交换条件选择原则1.对已知等电点的物质，在pH高于其等电点时，用阴离子交换剂，在低于其等电点时，用阳离子交换剂。2.等电点未知的物质，可参照电泳结果3.若吸附太牢，可改用交换当量较小的交换剂或改变条件降低交换剂上带电基团的解离度,.,19,5、根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质亲和层析法，即利用蛋白质分子能与其相应的配体进行特异的、非共价键的可逆性结合而达到纯化的目的。固相化金属亲和层析（IMAC）利用蛋白质分子中的咪唑基和巯基与一些金属元素（如Cu2、Zn2+等）形成配位结合，使蛋白质得到分离纯化。,.,21,6、根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质原理：蛋白质分子表面的疏水区与吸附剂上的疏水基团结合，再用洗脱剂（调节离子强度、极性、PH)将蛋白质洗脱下来。方法：疏水性相互作用层析应用：用含酚基疏水基团的琼脂糖纯化重组人表皮生长因子（rhEGF），纯度可达94%，回收率达82%。,.,22,7、根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质常用吸附剂：结晶磷酸钙（羟灰石）、磷酸钙凝胶、硅胶、皂土沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。应用：催产素、胰岛素、HCG、HMG、细胞包素C等的纯化,.,23,8、根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质逆流分溶：以化合物在两个不相溶的液相之间进行分配为基础的分离过程应用：垂体激素、氨基酸、DNA等的纯化。,9、根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质,.,25,二、多肽与蛋白质的化学合成,液相合成法在有机溶剂中进行的均相反应，始于50年代适用范围：分子量不太大的多肽（30肽以下）缺点：合成分子量较大的蛋白质时，产物不能表现出全部活力且不能结晶,固相合成法始于1962年适用范围：小肽的合成（30肽以下）缺点：对大分子的合成，还不能达到天然物质的全部活力（如124肽的核糖核酸酶）。,多肽合成的几个主要步骤：氨基保护和羧基活化；羧基保护和氨基活化；接肽和除去保护基团。,.,26,（一）基团保护,保护基必须具备的条件（1）易在预定的部位引入（2）易除去（3）引入和除去保护基时，分子中的其它部位不会受到影响，特别是已接好的肽键。,氨基保护剂：苄氧羰酰氯（Cbz-Cl）可用催化氢化法或钠氨法（用金属钠在液氨中处理）除去保护基叔丁氧羰酰氯（BOC-Cl）用稀盐酸或乙酸在室温除去保护基。,氯甲酸苄酯Benzoxycarbonyl（简写Z）,.,28,羧基保护剂种类：乙醇或甲醇引入：无水乙醇或甲醇在盐酸存在下进行酯化，使羧基接上烷基。脱除：常温下，氢氧化钠皂化法。,.,29,侧链的保护His咪唑基、Ser羟基、Tyr酚基、Cys巯基等的保护保护剂：苄基（B2），钠氨法除去。Glu和Asp的及-羧基的保护保护剂：-及-苯甲酯，催化氢化法除去。Arg胍基的保护保护剂：对甲基磺酰基（Tos-）。,.,30,（二）肽的液相合成法阶梯伸长法片断缩合法,.,31,1.阶梯伸长法,定义：将带有R-O-CO-型保护基的氨基酸（不是肽）的羧基活化，从肽的C-端开始每次接上一个氨基酸，逐步递增的办法。适用范围：合成比较小的肽或肽段。根据羧基活化方法不同,又分为:混合酸酐法和活化酯法,注意：一般采用羧基活化的方法，合成肽的常规方法是从C-端向N-端进行。（原因：活化氨基的反应激烈，且常常产生消旋化）,活化酯法（带有氨基保护的氨基酸对硝基芳香族酯与另一氨基酸酯的氨基缩合成肽）,DCC+N-端保护的Aa,(R1CO)2O,R2-NH2,R1-CO-NH-R2,混合酸酐法-DCC法：加入碳二亚胺缩合剂,H-Gly-OME,Z-Leu-OC6H4NO2,Z-Leu-Gly-OME,2.片断缩合法片断缩合法是由小肽缩合成大肽的方法，为避免消旋，常用叠氮法接肽。优点：产品光学纯度高（不消旋）。,.,34,（三）肽的固相合成法定义：在不溶性的聚苯乙烯树脂载体上进行肽链的延长。过程：1.C-末端的固定合成多肽的C-末端先和氯甲基聚苯乙烯树脂（氯化苄酯树脂）反应形成苄酯2.接肽按肽链一级结构的顺序将氨基端已被保护的氨基酸逐个加上去，使肽链延长。,在多肽合成中通常采用氨基保护,羧基活化的方法,.,35,多肽固相合成原理的发明1963年美国洛克菲勒大学教授Robert.BruceMerrifield发明了肽的固相合成法（BOC法）,成功地合成出了舒缓激肽（9肽）和具有124个氨基酸残基的核糖核酸酶,并因此于1984年获得了诺贝尔化学奖。,Robert.BruceMerrifield(1921-May,2006),固相法合成多肽反应示意图,羧基通过N,N-二环己基碳二亚胺（DCC,Dicyclohexylcarbodiimide）活化,BOC法固相合成多肽示意图,.,38,固相合成多肽的常用方法：t-BOC法氨基用叔丁氧羰基保护，最后一步脱保护和水解应用强酸HF，条件苛刻，不适宜于短肽的大规模自动化合成Fmoc法现在大多采用Fmoc法（byR.C.SheppardatCambridgeUniversity）氨基用9-芴甲氧羰基保护，最后一步脱保护和水解反应用弱酸TFA(三氟乙酸），条件温和，反应易监控。,9-芴甲氧羰酰氯,.,39,固相法合成多肽优点：最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，故可在一个反应容器中进行所有的反应，大大减轻了每步产品提纯的难度，便于自动化操作，可获得高产率，产物易分离。目前化学合成多肽可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行,研究型多肽合成仪,生产型多肽合成仪,中式型,中试型多肽合成仪,研究型多肽合成仪,.,41,固相法合成的多肽产品：催产素(9肽)、促黄体生成素释放因子（LRH，9肽）、胸腺肽（5肽），产量高，而且比天然产品好。,.,42,（四）游离肽的获得分离纯化：结晶法，层析法，等电点沉淀法，超滤法产品干燥：真空冷冻干燥或冷冻干燥（避免失活）,.,43,第二节多肽类药物,一、概述活性多肽来源：生物体的组织、细胞、体液等人工合成第一个人工合成的活性多肽催产素（1953年）神经肽，细胞生长调节因子（60、70年代）酶催化无活性的蛋白质前体酶加工剪切转化活性蛋白质、多肽,.,44,多肽药物的种类多肽激素垂体多肽激素、下丘脑激素、甲状腺激素、胰岛激素、胸腺激素多肽类细胞生长调节因子表皮生长因子（EGF）、转移因子（TF）、心钠素（ANP）含有多肽成分的其他生化药物蜂毒（肽）、蛇毒（肽）,.,45,二、主要多肽类药物的制备,（一）胸腺激素（Thymushormones）作用：对免疫功能（免疫缺陷病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤以及老年性退化性病变）有多方面的影响。用途：免疫调节剂,.,46,1、胸腺素（Thymocln）来源：小牛胸腺（1）结构和性质1)由4050种多肽组成的混合物2)80热稳定3)分子量在100015000之间4)等电点在3.59.5之间。,.,47,根据等电点以及在等电聚焦分离时的顺序而命名，共分三个区域：区：PI低于5.0的组分，区：PI在5.07.0之间的组分，区:PI在7.0以上者（此区内组分很少）。有活性的称为胸腺素，如胸腺素1，无活性的称之为多肽，如多肽1。,（2）生产工艺：,除杂蛋白：热变性法（要求目标蛋白有较高的热稳定性）沉淀：-10丙酮,避免有机溶剂引起蛋白失活硫酸铵分级沉淀：2550饱和度超滤：取透过液（MW物质PI，带负电，选阴离子交换剂介质PHPI,蛋白质带负电，在pH5.5-9.0范围内蛋白质和DEAE离子交换剂都是解离的，带相反电荷,当pH60析出沉淀)。,稳定性：对酸较稳定，较其他血浆蛋白质耐热（氯化钠或脂肪酸盐可提高其热稳定性）,分类：人血清白蛋白(健康人血浆)、胎盘血白蛋白（健康产妇胎盘血）,血浆蛋白,2、生产工艺,(5)除菌：先用压滤器澄清过滤，再用冷灭菌系统除菌,上清液供生产人丙种球蛋白,(1)利凡诺：乳酸依沙吖啶,白蛋白沉淀剂，充分搅拌、静置2-4h,分离上清液与络合沉淀,(2)解离：pH弱酸性,加0.15-0.2NaCL，不断搅拌解离,65恒温1h,冷却、离心、过滤（压滤机）,(3)浓缩：超滤(4)热处理：灭活病毒,.,64,冷灭菌技术,定义：冷灭菌是一种不用热能杀死微生物的新技术。与传统的热灭菌相比，不仅能杀死微生物，保证产品安全，同时还能较好地保持产品的生物活性。冷灭菌方法：膜分离（微滤0.2m、0.45m过滤细菌)、UHP（超高压灭菌）、辐射灭菌、高压脉冲电场,.,65,（二）干扰素（Interferon，IFN）1、结构和性质特点：干扰素诱生剂诱导所产生的一类高活性、多功能的诱生蛋白质。分类：人干扰素按抗原性分为、三型。（三种干扰素的理化及生物学性质有明显差异）,2、生产工艺干扰素的制备方法：人白细胞培养（以血库血大量制备，达到106Umg蛋白水平）基因工程发酵法：重组人-干扰素、重组人-干扰素国内已上市的干扰素品种：聚乙二醇干扰素-2b注射剂重组人干扰素-2b注射液重组人干扰素-1b滴眼液重组人干扰素-2a栓、凝胶注射用重组人干扰素-2a、-2b、-1b,(1)工艺路线（细胞培养法）：,PBS:磷酸钠缓冲液（NaCl,Na2HPO4，NaH2PO4）透析：溶解液作内液PBS作外液，除KSCN,1.白细胞的分离：离心分离血浆，吸取灰黄层（白细胞+红细胞），用氯化铵（0.83%）裂解红细胞，离心，收集白细胞，制成白细胞悬液,2.起动与诱生加少许白细胞干扰素，37培养h，再加适量诱生病毒，37培养12h，收集上清即为粗制干扰素，20保存。,3.纯化：KSCN（0.5mol/L,pH3.5）盐析，醇溶（94冷乙醇）、酸沉淀除杂蛋白，碱沉浓缩,4.溶解（0.5mol/L硫氰化钾0.1mol/LPBS，pH5.2）、透析除盐，除菌过滤、半成品检定，合格后分装，冻干。,.,68,（2）注意事项：血液分离白细胞：含ACD抗凝剂血液离心血浆灰黄层氯化铵溶血（除红细胞）离心白细胞干扰素诱导剂：仙台病毒（在10天龄鸡胚中培养4872h，收获尿囊液）或新城鸡瘟病毒（NDV）株,柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g，加水至1000ml,.,69,3、作用与用途作用：抗病毒、抗细胞分裂及免疫调节用途：（1）病毒性疾病：普通感冒、疱疹性角膜炎、带状疱疹、水痘、慢性活动性乙型肝炎。（2）恶性肿瘤：成骨肉瘤、乳腺癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等（3）病毒引起的良性肿瘤,.,70,（三）胰岛素（Insrlin）简介1922年从胰脏中提取得到的一种较纯的降血糖物质，命名为胰岛素1923年开始临床应用我国在1965年完成了结晶牛胰岛素的全合成工作胰岛素是世界上第一个人工合成的蛋白质迄今胰岛素仍是治疗胰岛素依赖型糖尿病的特效药,.,71,1结构和性质（1）结构：由51个Aa组成，有A和B两条链A链含21个Aa残基；B链含30个Aa残基A、B链由两个二硫键相连，A链本身还含有一个二硫键不同种属动物胰岛素的分子结构大致相同，差别主要在：A链二硫桥中间的第8、9和10位上的三个AaB链C末端的一个Aa上,人胰岛素B30苏氨酸猪、牛胰岛素B30丙氨酸,人、猪胰岛素（A链8，9，10位Aa）：苏、丝、异亮牛胰岛素（A链8，9，10位Aa）：丙、丝、缬,猪胰岛素结构图,B链C末端人的是苏氨酸，猪的是丙氨酸,抗原性比其他来源的胰岛素要低。,临床应用的动物胰岛素以猪胰岛素为主，其抗原性比其他来源（牛、马、羊、兔、狗）的胰岛素要低。,.,73,（2）胰岛素在体内的存在形式,胰岛素由胰岛的细胞产生，在细胞中开始时是以活性很弱的前体胰岛素原存在，进而分解为胰岛素进入血液循环,胰岛素原经蛋白酶水解切除C肽，得活性的胰岛素,胰岛素原是由C肽的一端与胰岛素A链N-末端相连，另一端与B链C末端相连,.,75,（3）胰岛素的性质：分子量：牛胰岛素为5733，猪为5764，人为5784。等电点：5.305.35。溶解性：在pH4.56.5范围内几乎不溶于水，易溶于稀酸或稀碱溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解；在90%以上乙醇或80%以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶。在高浓度锌的溶液中，pH68时胰岛素溶解度急剧下降。稳定性：在弱酸下或混悬在中性缓冲液中稳定,2.生产工艺,（1）酸醇法制备胰岛素工艺路线,胰尾（胰岛素含量高）,提取：胰片86-88乙醇5草酸；滤渣：68-70乙醇0.4草酸碱化：浓氨水除碱性蛋白（压滤）酸化：硫酸除酸性蛋白减压浓缩：上层清液，低于30，减压蒸馏浓缩、除乙醇去脂：速热（50）速冷（5）盐析：NaCL(27%)除酸性蛋白：H4.2-4.3低温丙酮沉淀、低温静置、低温离心锌沉淀:加醋酸锌溶液，与等电点沉淀配合使用除碱性蛋白、结晶、丙酮乙醚脱水,.,77,3、注意事项（1）冻胰：离体后，需立即深冻（蛋白水解酶分解胰岛素）。-30以下急冻后转入-20保存备用。液氮或干冰速冻，效果更好。胰尾胰岛素含量较高，单独使用，收率可提高10%。（2）结晶胰岛素的纯度国外标准：胰岛素原（10ppm)、脱酰胺胰岛素(1000ppm)我国：胰岛素原含量约为20000ppm,.,78,胰岛素的发展动物胰岛素重组人胰岛素胰岛素类似物,存在免疫原性问题,不能模拟生理性胰岛素分泌模式,作用时间、作用效果更佳,（提取或合成）,基因工程菌或半合成,分子改造或修饰,.,79,胰岛素结构改造和修饰胰岛素类似物优点：起效快、降糖能力高、半衰期长、抗热变性、抗蛋白水解酶的降解等。产品：1)重组赖辅胰岛素：人胰岛素B链的28位、29位脯氨酸和赖氨酸的顺序换位2)门冬胰岛素：利用啤酒酵母属，采用重组DNA技术，将人胰岛素氨基酸链B28位的脯氨酸由天门冬氨酸替代3)右旋糖酐胰岛素（化学修饰）,.,80,酶促半合成人胰岛素经胰蛋白酶的转酰胺作用，将猪胰岛素转化为人胰岛素B30。再用离子交换层析纯化，可得到高纯度人胰岛素。,胰蛋白酶,猪胰岛素B30丙氨酸,人胰岛素B30苏氨酸,重组人胰岛素的生产方法1)用基因工程大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)分别发酵生产人胰岛素(humaninsulin,hI)的A、B链,然后经化学再氧化法,使两条链在一定条件下重新形成二硫键,得到hI。（目前已较少使用）,.,82,2)用基因工程E.coli发酵生产人胰岛素原(humanproinsulin,hPI),后经加工形成hI。优点：E.coli系统表达量高缺点：产物易降解,故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后,表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hI,.,83,3)通过基因工程酵母菌发酵生产hPI,经后加工形成hI。优点：酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单缺点：生产周期长,且重组蛋白分泌量少(150mg/L),产量低,.,84,（四）生长素（Growthhormone，GH）1、结构和性质人生长激素由191个Aa组成，PI4.9，（猪为6.3）稳定性好，其活性在冰冻条件下可保持数年，在室温放置48h无变化。只有灵长类的生长激素对人有活性。,2、生产工艺,.,86,（2）工艺解析：提取：加水制匀浆，取沉淀沉淀先用0.1mol/L硫酸铵抽提（取沉淀），再用0.25mol/L硫酸铵抽提（取上清）分级沉淀：硫酸铵11.8mol/L(盐析沉淀）一次沉淀：取上清二次沉淀：取沉淀凝胶过滤SephadexG-75，用含NaCL的Tris-HCl洗脱DEAE-C层析：酸性蛋白适合用阴离子交换剂注意：当透析与凝胶过滤或离子交换组合操作时，一般选择与洗脱剂相似的透析外液。,.,87,3.人生长素（hGH)的研制动物生长素不能用于人体传统方法：从人尸体的脑垂体中提取生物技术：重组枯草杆菌系统表达hGH产量达1.5g/L4.临床用途治疗因垂体功能不全而引起的侏儒症,.,88,（五）胃膜素（Gastricmucin）1、结构和性质来源：猪胃粘膜主要成分：粘蛋白性质：遇水后膨胀成为粘液，遇酸即沉淀，遇热不凝固。其水溶液能被60以上乙醇或丙酮沉淀。与酸较长时作用，能分解成各种蛋白质和多糖组分。等电点为pH3.35。,2、生产工艺胃膜素、胃蛋白酶联产工艺（1）工艺路线：,（2）工艺解析：消化:酸水解，激活3h脱脂：氯仿丙酮分级沉淀：浓缩液与丙酮预冷，搅拌、缓加、静置沉淀用冷丙酮洗涤，洗涤液与母液合并，再用丙酮沉淀胃蛋白酶,.,90,3、作用和用途（1）黏附作用：在胃及十二指肠溃疡面形成一层保护膜，减少胃酸的刺激，利于溃疡面的愈合；（2）润滑作用：使进入消化道的食物易于在消化道内移行，有利于减少某些物质对溃疡面的刺激。,.,91,（六）绒膜促性激素（HCG）1、结构和性质:HCG是一种糖蛋白，由-链和-链两个亚基100个氨基酸组成，分子量4700059000。易溶于水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮等有机溶剂，等电点pI